CLSI M100-S25主要更新内容
随着抗菌药物耐药现象日益加剧，准确的药敏试验结果对临床优化治疗方案和提高感染性疾病的诊治能力至关重要。因此，建立和完善体外药敏试验的标准化操作规程，是加强微生物室自身能力建设、实现经验性向个体化治疗转型的基本要求。CLSI制定的药敏试验标准是我国遵循的指导性文件，其每年修订的内容都引起临床工作者的广泛关注。本文将重点介绍2015年CLSI
M100－S25[1]新增的Carba NP试验和流行病学cut－off值(epidemiological cut－off values,
ECVs)的概念，以供临床实验室参考。
一、Carba NP确证试验
Carba NP确证试验是CLSI M100－S25(2015年)新增的一种对肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动菌属细菌中碳青霉烯酶的表型检测方法。该试验采用比色法，目前可用于流行病学研究或感染控制，尚不推荐作为临床常规使用。
研究表明，Carba NP试验在检测肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动菌属细菌的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella
pneumoniae carbapenemase, KPC)、新德里金属β内酰胺酶(New Delhi
metallo－beta－lactamase, NDM)、verona integrin－encoded
metallo－β－lactamase(VIM)、imipenemase metallo－β－lactamase(IMP)、SPM和S.
marcescens
enzyme(SME)型碳青霉烯酶方面具有较好的敏感度(>90%)和特异度(>90%)，而对其他类型的碳青霉烯酶，敏感度和特异度则存在差异。例如，Carba
NP实验对OXA－48型碳青霉烯酶敏感度较低，仅为11%。此外，CLSI研究显示，2株对碳青霉烯类药物MIC较低而KPC酶阳性的菌株(1株对3种碳青霉烯类均敏感的阴沟肠杆菌；1株对美罗培南敏感，而对亚胺培南和厄他培南中介的大肠埃希菌)对该试验未表现阳性。
如果实验室使用M100－S20(2010年)中碳青霉烯类MIC折点，则需对Carba
NP试验的适用条件和报告方式进行调整。当肠杆菌科细菌的亚胺培南或美罗培南MIC为2～4 mg/L，或厄他培南MIC为2
mg/L时，实验室在使用修订后的碳青霉烯类MIC折点之前，都需要进行Carba NP试验或其他碳青霉烯酶的确证试验。此时，对于Carba
NP试验阳性的菌株，无论MIC值为多少，均报告为碳青霉烯类耐药；如果Carba
NP试验为阴性，则根据CLSI折点(M100－S20)判断碳青霉烯类的敏感性。值得注意的是，并非所有产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌Carba
NP试验都为阳性。
1．Carba NP试验试剂和配制说明：
2．检测流程：
(1)对于每株待测菌、质控菌株和未经处理的试剂质控，分别取两个微量离心管(标记为"a"和"b")。(2)向每管中加入100
μl细菌蛋白提取液。(3)对于每株待测菌，从过夜培养的血平板上各取一接种环(1 μl)的细菌，加入管"a"和管"b"中进行乳化。每管涡旋5
s(未经处理的试剂质控仅含细菌蛋白提取液)。注意不要从选择性培养基、含抗生素或含其他试剂的选择性平板上挑取菌落。(4)加入100 μl
A液到管"a"。(5)加入100 μl B液到管"b"。(6)将离心管充分涡旋。(7)35 ℃±2 ℃下孵育不超过2 h。2
h内呈阳性的菌株可报告为产碳青霉烯酶。
3．结果解读(见表2)：
(1)未经处理的试剂对照管"a"和"b"：两管必须是红色或橙红色。如其中任何一管为其他颜色，则试验结果无效。(2)接种管"a"：必须是红色或橙红色，如果管"a"为其他颜色，则结果无效。(3)接种管"b"：红色或橙红色为阴性；浅橙色、深黄色或黄色为阳性；橙色则结果无效。
4．结果报告：
结果阳性报告为产碳青霉烯酶；阴性报告为未检出碳青霉烯酶。
5．质控：
(1)实验当天需检测阳性和阴性质控菌株，以及未经处理的试剂质控管。将肺炎克雷伯菌ATCC
BAA－1705作为产碳青霉烯酶的阳性对照；肺炎克雷伯菌ATCC
BAA－1706作为阴性对照。(2)未经处理的试剂质控管"a"和"b"必须为阴性(红色或橙红色)。(3)当管"a"为红色时，管"b"中加入亚胺培南可能使管"b"显示橙红色。
二、对碳青霉烯酶检测的更新
医院感染控制或流行病学调查可能需要对产碳青霉烯酶的肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动菌属细菌进行检测。目前这些检测方法尚未用于临床常规中。如果使用当前CLSI的药敏折点，产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌通常对1种或1种以上碳青霉烯类中介或耐药(厄他培南不敏感是产碳青霉烯酶的最敏感标志)，同时对1种或1种以上三代头孢菌素耐药(如头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟和头孢曲松)。然而，某些产碳青霉烯酶的菌株[如产SME或imipenem－hydrolysing
β－lactamase(IMI)型碳青霉烯酶]常对上述头孢菌素敏感。当实验室使用M100－S20(2010年)文件中碳青霉烯类对肠杆菌科细菌的MIC折点时，即亚胺培南或美罗培南MIC为2～4
mg/L或厄他培南MIC为2 mg/L时，实验室应对怀疑产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌进行改良Hodge试验、Carba
NP试验和(或)分子检测。这3种检测方法的比较见表3。
三、ECVs的引入
CLSI
M100－S25新增加了万古霉素对痤疮丙酸杆菌的流行病学cut－off值。当临床考虑使用万古霉素治疗痤疮丙酸杆菌感染时，由于缺乏足够的临床治疗数据，因此目前尚无万古霉素对痤疮丙酸杆菌的MIC折点。根据ECVs，万古霉素对未出现获得性和(或)突变性耐药的野生型痤疮丙酸杆菌的MIC≤2
mg/L。ECVs可用于检测对特定药物敏感性下降的菌株。如果痤疮丙酸杆菌获得耐药基因或基因突变，可引起其对万古霉素敏感性下降(MIC≥4
mg/L)。根据既往经验，非野生型痤疮丙酸杆菌感染可导致万古霉素治疗效果不佳。
1．ECVs的定义：
ECVs是根据体外药敏表型(MIC值)来区分有无获得性和(或)突变耐药细菌，该MIC值即为ECVs。ECVs仅基于体外药敏数据。"野生型"(wild－type，WT)指MIC值≤ECV，说明菌株无获得性和(或)突变耐药；而"非野生型"(non－wild－type，NWT)指MIC高于ECV，则菌株有获得性和(或)突变耐药。ECVs不同于临床折点，主要用于标识NWT菌株的出现和发展。
2．ECVs的确定：
ECVs是通过收集和汇总不同来源细菌的MIC值来估计野生型菌株MIC值分布的上限获得的。为了得到可靠的ECVs，必须具备以下条件，包括：(1)由于同一属而不同种的细菌基因存在差异，只能确定单一菌种的ECV。(2)纳入数据集中的MIC值必须是采用参考方法(如CLSI推荐的MIC肉汤稀释法，该方法也需得到ISO－20776－1认可)确定的。(3)用于确定ECV的数据集应不少于100株菌，且必须来源于至少3个独立的实验室。(4)每个独立实验室数据集包括的MIC值分布应尽可能在稀释范围内(且为可评价的)，该条件特别适用于估计野生型菌株。在合并ECV数据之前，应检查每个实验室的MIC分布数据。如果检测的最低浓度为众数，则这些数据不能纳入数据集。
估算ECV最简单的方法是通过目测确定野生型和非野生型MIC分布的界限，但存在偏倚。而统计学方法能够很好地去除观察者估算时的偏倚。因此，当野生型和非野生型存在明显重叠时，更倾向于统计学方法。
3．如何使用ECVs建立临床折点：
临床折点的建立需基于大量数据，包括抗菌药物的MIC分布、细菌种群、体内和体外药效学、人体药代动力学和临床疗效。因此，MIC分布和ECVs都是用于建立临床折点的一部分。
4．临床微生物室如何使用ECVs：
例如，万古霉素可用于治疗痤疮丙酸杆菌感染，但目前尚无足够的数据建立临床相关折点。这主要与获得性耐药菌株的出现和缺乏临床疗效数据有关。
当万古霉素MIC处于或低于ECV(≤2 mg/L)时，可以推断菌株为野生型；当万古霉素MIC为≥4 mg/L时，菌株应重新进行药敏检测以确定是否为非野生型。ECVs不可用于临床折点，且检测的MIC结果不应报告为敏感、中介或耐药。
四、主要细菌的相关更新
M100－S25文件在"建议检测和报告的药物"部分删除了加替沙星、格雷沙星、洛美沙星、替卡西林和曲伐沙星。
1．肠杆菌科细菌的相关更新：
CLSI 2015年将磷霉素加入"常规试验和报告药物U组"，强调仅用于泌尿道大肠埃希菌的检测和报告。同时增加了阿奇霉素和培氟沙星对伤寒沙门菌和沙门菌属的药敏折点，见表4。
2．厌氧菌：
大多数厌氧菌感染为多种病原菌联合感染，包括β内酰胺酶阳性和阴性的菌株。临床实验室通常不必对多种病原菌进行药敏试验。而2015年新版标准扩大了对厌氧菌进行药敏试验的范围，建议如果需要，应对最可能耐药的微生物(如脆弱类杆菌)进行药敏试验并报告结果。此外，当抗菌药物对厌氧菌的MIC为中介时，临床应使用最大剂量并联合适当的辅助治疗，使药物在脓肿和(或)低灌注的组织中达到最佳浓度。
3．肺炎链球菌：
建议检测苯唑西林纸片质量。使用纸片扩散法时，实验室最好通过金黄色葡萄球菌ATCC 25923检测苯唑西林纸片质量，结果可接受的范围为18～24 mm(MH平板)。
4．肠球菌属：
将磷霉素加入"常规试验和报告药物U组"，仅用于泌尿道粪肠球分离株的检测和报告。
五、关于药敏质控和试验操作的更新
M100－S25除新增了培氟沙星对大肠埃希菌ATCC25922纸片法的质控范围(25～33
mm)外，还修订了下列药物对肺炎克雷伯菌ATCC700603的质控范围，见表5。此外，文件增加了实验室对大肠埃希菌ATCC
35218的处理建议，以确保其产生β内酰胺酶，可用于β内酰胺类/β内酰胺酶抑制剂药物的质控。ATCC 35218需在－60
℃储存，如果连续传代，可能丢失含有编码β内酰胺酶基因的质粒。为了确保大肠埃希菌ATCC
35218保持其产生β内酰胺酶的能力，当首次从冷冻或冻干保存菌株传代时，应通过纸片或稀释法检测其对氨苄西林、哌拉西林或替卡西林的活性。如果上述抗菌药物检测结果在质控范围，则大肠埃希菌ATCC
35218可作为β内酰胺类/β内酰胺酶抑制剂的质控菌株。
参考文献
[1]CLSI.
Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing:
Twenty-Fifth Informational Supplement. CLSI document M100-S25. Wayne,
PA: CLSI, 2015.
