相互作用蛋白的捕获实验
基本实验
| 实验材料 | 酵母菌 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | CM培养基 乙酸锂 PEG TE DMSO 甘油 氨苄青霉素 |
| 仪器、耗材 | 离心机 分光光度计 摇床 培养箱 |
| 实验步骤 |
1. 为了转化文库，将约20 ml 含pSH18-34和pBait 的酵母菌EGY48培养液接种到Glc/CM-Ura-His 省却成分液体培养基中，于30℃培养过夜。
3. 室温下1 000~1 500 g 低速离心5 min，收集酵母菌细胞。菌体用30 ml 无菌水重悬，并移至锥形离心管中。
6. 分别加入300 μl 40% pEG 4 000/0.1 mol/l 乙酸锂/TE，颠倒混合直至完全混匀，于30℃温育30 min。
7. 加入DMSO到终浓度10%（每管约加40 μl ），顛倒混匀，在42℃加热板上热休克10 min。
9. 收获转化子，将30个24 cm×24 cm 长有转化子的平板在4℃下放置冷却数小时，使琼脂变硬。
10. 戴上手套，使用无菌显微镜用的玻片，轻轻地从平板上将酵母菌细胞刮下来。将30个平板上刮下来的细胞收集到1个或2个50 ml 无菌的锥形试管中。
12. 用1体积的甘油液重悬沉淀的酵母细胞，混合后分装成每份1 ml，于-70℃冻存。
16. 为了选择阳性克隆，解冻适当量的转化酵母，按照步骤13稀释，培养，并以每平板接种106细胞的密度涂布100 mm 的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基平板。对于每个初次获得的转化子，涂布后应保证长出3~10个细胞，用Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省却成分培养基稀释酵母菌，于30℃培养2~3天。
17. 待长出菌落后，小心地将菌落转至新的Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省却成分培养基主平板上，较早出现的菌落一般较可能是真阳性的，于30℃培养。
18. 再从Gal/Raff/CM-Ura-His-Trp-Leu 省却成分培养基主平板上挑菌落转至100 mm 的Glc/CM-Ura-His-Trp 省却成分培养基主平板上，于30℃培养至菌落可见为止。
19. 从Glc/CM-Ura-His-Trp 作主平板上挑菌或直接影印平板上菌落至以下平板上。
20. 针对阳性菌落（在含Xgal平板上显蓝色，并可在Gal/Raff/CM-Leu 如平板上生长但不能在Gcl/CM-Leu 平板上生长的），采用快速小量制备方案从酵母菌中分离质粒DNA，将从15 μl 培养物制得的总DNA浓缩至5~10 μl。
21. 用制备好的质粒DNA转化感受态细菌KC8。涂布于LB/氨苄青霉素平板，37℃过夜培养。
22. 在LB/氨苄青霉素平板上长出的菌落挑至或影印在添加了Ura、His和Leu但不加Trp的细菌极限培养基平板上，以选择pJG4.5质粒，37℃过夜培养。
24. 为了分别在不同的转化实验中进行特异性验证，用步骤23纯化的质粒转化已含有下列质粒并生长在Glc/CM-Ura-His 平板的酵母菌。
27. 从主平板上挑或影印菌落至在实际筛选中所用的同一系列的验证平板上：
（1）Glc/Xgal/CM-Ura-His-Trp
28. 作特异性验证实验。分析并测定阳性质粒的DNA序列。
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