常规切片制备的注意事项（二）
6. 包埋
用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整，二是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上。修去两边的余蜡（所谓的两边，指切片时与切片刀垂直的两侧）。包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取最大包埋面，应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56～58℃之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
7. 磨刀
要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均匀，使刀口和磨刀石全面接触，两手的用力点应在刀口上，而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次，每次仅需10～15分钟，过长时间的磨刀，容易把已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀是否锋利，用手试摸刀口的方法并不十分科学，不仅不能证明切片刀是否真正锋利，而且容易损害刀口，最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后，应将磨刀石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握，故效果并不理想。根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片，必须及时更换刀口。一个刀口切小标本不应超过20～25只蜡块，切大标本不应超过10～15只蜡块。
8. 切片
切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在５0～100微米左右，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块表面均匀一致，无白点后，再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，机器磨损；过慢会使切片增厚。切片厚度一般3～5微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等，这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重。对脱钙组织、骨髓，以及已知的钙化组织，应选用固定的刀口，以减少其他部位出现缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增加一个缺口。切片厚度一般为4～6微米，有人认为：只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时，切的片子都会变厚，只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法：(1)组织发脆：一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。(2)切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚等等。(3)蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。(4)
透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结,
也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块发白，内陷：组织脱水不佳。补救办法：可先将蜡块溶解，取出组织，放入加热水浴的丙酮内（80℃），30～60分钟，再进行透明浸蜡包埋切片，也许会好一点。
9. 展片与捞片
展片水温应在42℃至47℃之间，这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯，也会造成石蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展开，这有二个方法可以解决：第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子就会非常平整，放到热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点；第二、在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片子会较薄;如酒精浓度过高，容易引起切片破碎，出现裂隙，像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开，故不能用此法。最后捞片时玻片要干净，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
10. 烤片和脱蜡
烤片，一般在60℃的温箱内烤片0.5～1小时左右，温度过高，会引起切片细胞收缩；时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀，所以，脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用3道二甲苯，每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37℃左右）脱蜡，最高不得超过60℃。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯，至水。
11. 染色
苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定，一般为5－15分钟。经水略洗后，用盐酸酒精分化，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化，并充分水洗（流水冲洗5分钟以上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存，容易褪色。最后入伊红复染（5－20秒）。HE染色的关键在于深浅适度，对比鲜明，一般有经验的，肉眼就能判断，但偶而也会出现失误，所以用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程，在蓝化结束后，应在显微镜下观察细胞核着色是否合适，核结构是否清晰，胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是：细胞核与细胞浆应蓝红相映，鲜艳美丽；核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。
12. 脱水和封片
切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，纯酒精2道，（正丁醇1道），二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红退色，故脱水时间可短一点，每道3－5分钟，纯酒精每道10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但用石碳酸时如不洗净，可引起切片退色，不利于切片久存，故不作推荐。切片经二甲苯透明后，用中性树胶封固。为增加切片的透明度，防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点。所以我们规定切片必须湿封，不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季节，封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片；在天气较潮湿的日子里，不宜一次将多张切片取出待封，以免切片“还潮”，形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀，封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖，也不能有气泡。最后，粘贴标签，标签必须贴于玻片左侧，编号书写清楚，最好能打印。
