需氧革兰阳性杆菌检验
概述：临床标本或经培养后（24～48小时）的菌落涂片革兰染色，在镜下观察菌体的形态和染色可做初步鉴定。
规则的革兰阳性杆菌为菌体两侧平行不弯曲，不规则革兰阳性杆菌为菌体两侧弯曲不平行。
需氧革兰阳性杆菌种类繁多，广泛分布于自然界，常栖息于水和土壤中，其中多数为人和动物的正常菌群，致病性因菌种而异，多为条件致病菌，有的为人兽共患病原菌，少数细菌具有高度致病性。
根据细菌形态及是否产生芽胞可将革兰阳性杆菌分为四群：
①规则的无芽胞需氧革兰阳性杆菌：李斯特菌属 (Listera)、丹毒丝菌属 (Erysipelothrix)等；
②规则的可形成芽胞的需氧革兰阳性杆菌：芽胞杆菌属 (Bacillus)等；
③不规则的或棒状的需氧无芽胞杆菌：棒状杆菌属 (Corynebacterium)、加德纳菌属 (Gardnerella)等；
④需氧放线菌：诺卡菌属 (Nocardia)、放线菌属 (Actinomyces)、分枝杆菌属 (Mycobacterium)等。
第一节 芽胞杆菌属（Bacillus）
一、 分类与命名
隶属于芽胞杆菌科 (Bacillaceae)，为一群革兰阳性杆菌，有氧条件下形成芽胞为其主要特征。
芽胞杆菌属DNA G+C含量为32～69mol％，代表菌种为枯草芽胞杆菌。
① 枯草芽胞杆菌群：枯草芽胞杆菌 (B.subtilis)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)等；
②蜡样芽胞杆菌群：蜡样芽胞杆菌 (B.cereus)、炭疽芽胞杆菌 (B.anthracis)等；
③环状芽胞杆菌群：迟缓芽胞杆菌 (B.lentus)和凝固芽胞杆菌 (B.coagulans)等；
④其他芽胞杆菌：巨大芽胞杆菌 (B.megaterium)等。
能引起人类致病的菌种主要是炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌，其余多为污染菌。
一、 生物学特性
形态染色，培养特点，生化反应，抗原结构，抵抗力
（一）炭疽芽胞杆菌
炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)菌体较大，（1～1.25）µm×（3～5）µm，两端平截，在动物或人体标本中，菌细胞常单个或短链状排列；经培养后则呈长链如竹节状（图17-1），无鞭毛，有明显荚膜（图17-2）；在有氧及温度适宜（25～30℃）的环境中易形成椭圆形芽胞，位于菌体中央，折光性强；在陈旧性培养物中仅见芽胞。
需氧或兼性厌氧，最适生长温度30～35℃。在普通培养基上形成灰白色、扁平、干燥、粗糙型菌落，边缘呈卷发状（图17-3）；在血平板上菌落不溶血或弱溶血。在液体培养中生长卷绕成团呈絮状沉淀物，液体澄清无菌膜。有毒株在0.7%碳酸氢钠培养基，5％～7％CO2孵育过夜后可产生荚膜，形成黏液性菌落，无毒株为粗糙型。
在明胶培养基中，细菌开始沿穿刺线生长，并向周围散发短的突起如倒松树状，上部液化似火山口，生长较缓慢需数日。该菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、蕈糖，迟缓分解甘油及水杨苷，产酸不产气，还原硝酸盐为亚硝酸盐，不产生靛基质和硫化氢，枸橼酸盐、脲酶阴性。
本菌芽胞的抵抗力很强，干热140℃3小时或高压蒸汽121.3℃ 15分钟才能杀灭。芽胞在干燥土壤或动物皮毛中可存活60年以上，一旦污染，可维持长时间的传染性。芽胞对化学消毒剂中的碘和氧化剂较敏感。
（二）蜡样芽胞杆菌
蜡样芽胞杆菌(B.cereus)菌体两端稍钝圆，单个或长链状排列，无荚膜，有鞭毛，能运动。芽胞椭圆形，位于中央或近端（图17-4）。在普通琼脂平板上生长的菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，直径4～6mm，菌落常沿划线蔓延扩展成片如白蜡（图17-5）。在血平板上菌落呈浅灰色，毛玻璃样，伴草绿色溶血或透明溶血环。该菌能利用枸橼酸盐，产生淀粉酶，发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素和蕈糖。
二、 鉴定鉴别及重要鉴定试验
炭疽芽胞杆菌实验室检验工作要在三级生物安全实验室进行。检验时必须严格按甲类传染病检验守则操作，应送有关专门实验室作进一步鉴定。首先确认待检菌株是否为需氧内生芽胞菌，可采用芽胞染色后油镜检查芽胞的形态和位置（具有种的特异性），芽胞检查比菌落特征更有助于芽胞杆菌各菌种的鉴别。
1.属内鉴别
（1）炭疽芽胞杆菌与本属常见菌种的鉴别 见表17-1。
2.鉴定 枯草芽胞杆菌是实验室污染的常见菌，一般情况下不致病，鉴于易污染，应与炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌鉴别，以免误诊误报。
3.鉴定试验 下述均为炭疽芽胞杆菌鉴定试验。
（1）串珠试验 将待检菌接种于含0.05～0.5U/ml青霉素的培养基中35℃培养6小时后，炭疽芽胞杆菌形态发生变化，菌体成为大而均匀的圆球状成串排列，为炭疽芽胞杆菌特有的现象（图17-6）。
（2）青霉素抑制试验 炭疽芽胞杆菌在5U/ml的青霉素平板上可生长，在含≥10U/mL 的青霉素平板上受到抑制不生长。
（3）重碳酸盐毒力试验 将待检菌接种于含0.5%NaHCO3和10%马血清的平板上，置10% CO2环境中35℃培养24小时，有毒株产生荚膜，形成M型菌落，无毒株形成R型菌落。
（4）植物凝集素试验 根据炭疽芽胞杆菌菌体多糖是某些植物凝集素受体的原理，可用凝集素试验检测该菌。常用方法有荧光标记试验、酶联免疫吸附试验。
（5）噬菌体裂解试验 取待检菌新鲜肉汤培养物涂布于普通营养平板，将AP631 噬菌体液滴加于平板，培养12～18小时后，出现噬菌斑为试验阳性。炭疽芽胞杆菌为阳性结果，其他芽胞杆菌为阴性。该试验已作为国家进出口商品检验局发布的“出口畜产品中炭疽芽胞杆菌检测方法”的行业标准。
（6）核酸检测 从质粒pXO1中提取编码保护性抗原（PA）的DNA片段，经PCR扩增，制备32P标记的核酸探针，用原位杂交技术检测标本中相应基因片段，该技术特异性强，重复性好。
三、 抗菌药物敏感性
炭疽芽胞杆菌对青霉素、红霉素、庆大霉素、氯霉素、链霉素，环丙沙星、多西环素敏感，对头孢菌素耐药，早期使用氟喹诺酮类、联合一种敏感抗菌药物，能提高生存率。
蜡样芽胞杆菌可产生广谱β-内酰胺酶，从而对青霉素、氨苄西林、头孢菌素耐药，二种细菌同时对甲氧苄啶也耐药，但对克林霉素、红霉素、氯霉素、万古霉素、氨基糖苷类、四环素、磺胺类抗菌药物敏感，口服环丙沙星对蜡样芽胞杆菌引起的伤口感染有效，早期克林霉素联合庆大霉素对眼部感染效果最佳。
对其他芽胞杆菌，可选用青霉素及衍生物、头孢菌素。应注意在临床标本中已分离到对万古霉素耐药菌株。
四、 临床意义
炭疽芽胞杆菌是炭疽的病原菌，主要传播途径为摄入污染食物或皮肤接触，引起肺、皮肤、肠的炭疽病，均可并发败血症和炭疽性脑膜炎，近年来其作为一种生物恐怖武器而受到人们的关注。任何时候分离到炭疽芽胞杆菌都应重视，须立即向有关部门报告。
蜡状芽胞杆菌广泛分布于自然界的土壤、水和尘埃中，易污染米饭、淀粉、乳及乳制品、果汁等富含蛋白的食品，引起食物中毒，并可导致败血症，心内膜炎、创伤和肺部感染，该菌还可引起人类爆发性眼感染，甚至导致眼球摘除或失明，因此，若在眼睛分泌物中分离到该菌应立即与临床联系。
食品低度污染需氧芽胞杆菌非常常见，因此，判定需氧芽胞杆菌性食物中毒的标准应包括：①从可疑食物分离到可疑菌株，细菌量＞105CFU/g（可疑菌株为怀疑蜡样芽胞杆菌食物性中毒，检测到催吐毒素和（/或肠毒素）；②从急性感染患者样本中分离到大量与食品检出菌株相同的生物突变株或质粒型菌株
除了炭疽芽胞杆菌外，绝大多数芽胞杆菌都是环境中的污染菌，单次从临床标本分离到，没有临床意义。但当从临床标本中分离到的需氧芽胞杆菌为纯培养或优势生长菌株，或多次从临床标本检测到同一菌株时，应考虑潜在的临床意义。从伤口标本多次分离到中等量或大量需氧芽胞杆菌通常有意义，血液中多次获得纯培养，也需要慎重考虑。
