尖锐湿疣的病原学诊断试验
[摘要]目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）在尖锐湿疣诊断方面的作用。方法：第一阶段用FQ－PCR检测病理确诊的CA组15份标本和健康对照组35份标本；第二阶段用FQ－PCR及病理诊断同期检测临床送检病例53份标本，并做诊断性试验评价。结果第一阶段15例病理确诊的尖锐湿疣患者HPV611DNA的FQ－PCR全部阳性，平均拷贝数为1.0×107±1.0×102/ml；35例健康对照组FQ－PCR全阴，平均拷贝数为0～30/ml。FQ－PCR与病理诊断符合率为100％，CA组与健康对照组的拷贝数有显著性差异，P<0.05。第二阶段FQ－PCR与病理诊断对比得出：灵敏度Se为100％，特异度Sp为95.2％，误诊率α为0.048，漏诊率β为0，准确度为98.1％，阳性预测值为97.0％，阴性预测值为100％，阳性似然比为20.8，阴性似然比为0。结论FQ－PCR能准确定量，灵敏度高，特异性强，快速，简便，可作为尖锐湿疣早期诊断的指标。
关键词：尖锐湿疣；人乳头瘤病毒DNA；荧光定量聚合酶链反应
尖锐湿疣(Condyloma
Acuminatum，CA)又称生殖器疣或性病疣，是由人乳头瘤病毒(Human Papilloma
Virus，HPV)感染而引起的一种常见的性传播疾病，以感染HPV611为主。有典型临床症状的CA较易诊断，而非典型的CA与扁平湿疣，珍珠样阴茎丘疹病，生殖器鳞癌等假性湿疣的鉴别则较为困难。由于HPV至今尚不能在体外培养，且其免疫原性很弱，血清学方法灵敏度极低。组织病理学诊断需时间长，灵敏度低，存在假阴性，且对发生于粘膜部位的尖锐湿疣，病理学诊断有一定困难。目前发展迅速，应用较广的荧光定量聚合酶链反应（Flurogenic
Quantitive Polymerase Chain
Reaction，FQ－PCR）具灵敏度高，特异性强，假阳性低的特点。本文用FQ－PCR方法来准确定量检测HPV611DNA的含量，试图为CA的早期诊断和非典型CA的诊断提供依据。
对象与方法
一、研究对象第一阶段选择我院1999年9月至2000年5月妇科，皮肤科及泌尿外科门诊病人50例。将症状，体征典型，病理诊断为尖锐湿疣患者15例作为CA组，其中男7例，女8例，年龄最小18岁，最大47岁，平均（29±6.3）；将35例健康体检者作为健康对照组，其中男16例，女19例，年龄最小的19岁，最大的45岁，平均（28±5.2）。第二阶段选择我院2000年6月到2001年3月妇科、皮肤科及泌尿外科门诊送检病例53份标本，同期做FQ－PCR及病理诊断，并进行诊断性试验评价。取上述病人的组织块或分泌物放入1ml生理盐水试管中，冰箱4℃保存。
二、设备与试剂试剂由中山医科大学达安基因诊断中心提供。仪器为PE－5700荧光分析仪。
三、制备模板与扩增
1.制备模板:从生理盐水试管中将组织块取出，捣碎，放入50ul提取液，在沸水中煮10 min，12000r/min离心5min。吸取上清液2ul加入反应管，振荡混匀，然后离心5－10s。
2.扩增：将制备好的反应管放入PCR仪，93℃预变性2min，然后按93℃变性45s，55℃退火120s，反复扩增40个循环后直接在PE－5700上分析荧光值。
结果1．CA组与健康对照组检测结果：组别N病理诊断FQ-PCR阳性例数检测DAN
阳性例数阳性率(%)阳性例数X+-S(拷贝数KMml) CA组15 15 100 15 100
1.0*10的7次方+-1.0*10的2次方健康对照组35 0 0 0 0 0`30
2．53例临床诊断试验结果：见表2
FQ-PCR病理诊断合计CA未患CA 阳性32(A) 1(B) 33(A+B) 阴性0(C) 20(D) 20(C+D) 合计32(A+C) 21(D+B) 53(N) 灵敏度(Sensitivity Se)=×100％=×100％= 100.0％
特异度(Specificity SP)=×100％=×100％= 95.2％
误诊率(mistake diagnostic rate,α) = = = 0.048
漏诊率(omission diagnostic rate,β) = = = 0
准确度(accuracy)=×100％=×100％= 98.1％
阳性预测值(positively predictive value)=×100％=×100％= 97.0％
阴性预测值(negatively predictive value)=×100％=×100％= 100％
阳性似然比(positively likelihood ratio)= = = 20.8
阴性似然比(negatively likelihood ratio)= = = 0 讨论
CA在临床上可分为潜伏期，亚临床期和临床期。潜伏期从3周到8个月，平均约3个月。潜伏期是CA的最早阶段，潜伏期患者仅仅是HPV携带者，无任何临床症状和体征，HPV感染后皮损仍未产生异种蛋白，也没有组织病理改变，但该期患者是重要的传染源，如在此期能检测出HPV感染，则对早期防治、阻断传染源、减少HPV的感染有很大的临床价值。
目前HPV感染的实验室诊断方法主要有两大类，第一类是检查HPV的感染间接证据，如醋酸白试验，细胞学及组织学检查等。由于这些方法检测的是HPV感染后对机体造成的异常变化，而HPV感染后对机体造成特定的异常变化需要一定的时间，因此这些方法只能检测出CA的亚临床期和临床期，检测不出CA的潜伏期，对临床的早期诊断意义不大。而且醋酸白试验特异性不高，有些慢性炎症可出现假阳性结果。巴氏涂片敏感性不高，在已经确诊的CA患者中仅有25％～50％的患者可找到空泡化细胞。组织病理检查找到空泡化细胞可确诊为CA，但未见空泡化细胞则不能排除CA。第二类是检查组织中是否有HPV存在，如免疫组化，核酸分子杂交，PCR检查及超薄切片电镜技术或负染技术等。由于这些方法检测的是HPV感染的直接证据，在时间上可比第一类方法能更早地检测出HPV感染，更适合CA的早期诊断。免疫组化检测标本中是否存在HPV抗原，敏感性低，特异性高，繁琐、费时，目前已逐渐被淘汰。核酸印迹杂交的灵敏度及特异性均较高，但费时，繁杂，花费大，需用新鲜标本，实验室条件要求高，目前还未普遍用于临床。超薄切片电镜技术及负染技术可在电镜下看到典型的乳头瘤病毒颗粒，但受实验条件限制，一般的实验室很少采用。
聚合酶链反应是模拟DNA体内复制过程，进行特定的模板DNA片段的体外复制，复制后模板DNA可以上百万倍的增长，增加了检出的敏感性，因此，PCR方法是目前检出HPV感染最敏感的方法，特异性也很高，快速，简便，在临床上已广泛使用。文献报道用PCR方法检测CA患者HPVDNA阳性率为82.5％及98.4％[2]。但由于扩增产物量多，且以气溶胶的形式扩散，在开盖吸取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测时极易造成实验室的污染，导致假阳性结果。
实时定量PCR是近年发展起来的、倍受关注的定量PCR技术，FQ－PCR是其中的一种。FQ－PCR在PCR的基础上进行改进，克服了实验室污染的缺点，保持了灵敏度、特异性高的优点，还能进行准确定量，使常规PCR实现了从定性到定量的革命性飞跃。FQ－PCR采用了Taqman荧光探针技术，比常规PCR多一个寡聚核苷酸探针，该探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，发光分子产生的荧光被淬灭分子全部吸收，故完整的探针正常时无荧光。在PCR过程中，特异的荧光探针与模板结合，Taq酶分子在链延伸期通过自身的5｀→3｀核酸外切酶把荧光发光分子从探针上切下来，与淬灭分子分开，在激发光激发下产生特定波长的荧光，荧光强度与PCR扩增产物量及原始DNA模板量之间呈正相关关系，经测定荧光强度可进行原始模板的定量分析。由于整个扩增和检测过程均为闭管操作，不需开盖吸取扩增产物进行电泳，避免了PCR扩增产物的污染，减少了假阳性结果[1]。
表1用FQ－PCR检测CA组HPV6,11DNA，得出数据表明：CA组和健康对照组的FQ－PCR与病理诊断符合率为100％，2组阳性率及平均拷贝数有显著性差异(P<0.05)。
表2数据表明：FQ－PCR的准确度、灵敏度、特异度都很高，误诊率很低，漏诊率为0。
表2一例病理诊断为阴性，FQ－PCR检出HPV阳性，存在三种可能。第一种可能是FQ－PCR的假阳性，第二种可能是病理组织检查的假阴性，因为即便未见空泡化细胞也不能排除CA，需经多处取材，连续切片，且位于粘膜部位的CA因取材难而易导致病理检查漏诊，出现假阴性结果。第三种可能该患者是HPV携带者，正处于CA潜伏期，尚未引起典型的病理形态学改变，而FQ－PCR比病理组织检查能更早期地检测出少量的HPV感染。
FQ－PCR检测HPV611DNA的含量比定性能更直观的反映CA的严重程度，具有准确，，特异的优点，而且操作简单，快速，在临床上值得推广应用。在大多数方法学明显滞后于临床症状的情况下，FQ－PCR能检测出CA的潜伏期，对CA的早期诊断，早期防治有很大的临床价值，可作为CA早期诊断的指标。
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