快速、可靠的分析贝类中亲脂性海洋生物毒素】
本文采用UPLC/MS/MS法对海洋中生物毒素进行快速、可开的定量分析。这是一种能够快速、可靠地分析贝类中管制和非管制亲脂性海洋生物毒素的方法。与传统的HPLC/MS/MS方法相比，其分析速度提高了4倍(单次分析由20 min缩短为5 min)，可用于代替传统的小鼠生物检测法。
食用受到生物毒素污染的贝类(贻贝、牡蛎、蛤等)可能会引起人体严重中毒，如腹泻性贝毒(DSP)。通常将DSP毒素归类为亲脂性海洋生物毒素，由多种浮游植物自然产生，因此也称之为藻毒素。亲脂性海洋生物毒素含有羧酸、磺酸、氨基和亚氨基等官能团，所以有一定的复杂性。
欧盟(EU)立法对不同类别的毒素进行管制，并在官方控制程序中具体介绍了对这些毒素实施监控的方式。如图1所示。
在2011年7月之前，上述毒素的官方检测方法是生物检测法，该方法基于大鼠口服贝类肉或小鼠腹腔注射贝类提取物进行检测。这种方法主要存在两个问题：第一，有违生物伦理学;第二，不能科学地、可靠地测定痕量的特定毒素。
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图1.a)管制毒素和b)非管制环亚胺类毒素的化学结构式。
采用生物检测法进行检测时，环亚胺类毒素的存在通常会使动物致死。环亚胺类毒素如图1(B)所示，被归类为亲脂性海洋毒素。虽然这些毒素目前尚未受到管制，但欧洲食品安全局(EFSA)指出，这类毒素的毒性数据以及在贝类中的存在数据应当被更多地收集。
自2011年7月起，LC/MS/MS成为贝类中亲脂性海洋生物毒素的官方检测方法。欧盟引用的LC/MS/MS方法是使用固定的提取步骤提取生物毒素，再通过传统LC方法在酸性或碱性流动相下进行分离，并使用串联四极杆质谱进行检测。
本次研究的目的是建立一种在碱性条件下比传统LC方法更快速的常规分析方法，其中也包括EFSA关注的其他非管制类化合物的分析。在本应用纪要中，我们使用Waters® ACQUITY UPLC系统串联Xevo TQ-S质谱仪，对包括部分非管制环亚胺类毒素在内的多种亲脂性海洋生物毒素进行了5min的检测分析。UPLC®技术能够缩短分析运行时间，并且不会对色谱峰分离度和峰质量产生不良影响;Xevo TQ-S(串联四极杆质谱仪)可提供超高灵敏度的检测，还能够在切换电喷雾正离子(ESI+)和负离子(ESI-)模式下同时采集多重反应监测(MRM)跃迁数据，该采集过程是分析亲脂性海洋生物毒素的必需步骤。
表1. 亲脂性海洋生物毒素的欧盟限制浓度和建议报出浓度。*为食用贝类
亲脂性海洋生物毒素
欧盟限制浓度
（MMS）
（μg/kg）
0
0.125
0.25
0.5
1
1.5
OA 、DTX1 、DTX2 、PTX2
160 μg OA 当量/kg*
0
20
40
80
160
240
AZA1 、2、3
160 μg AZA1 当量/kg*
0
20
40
80
160
240
虾夷扇贝毒素
1000 μg YTX 当量/kg*
0
125
250
500
1000
1500
GYM 、PnTX-E 、PnTX-F
200 μg/kg*
0
25
50
100
200
300
SPX1
100 μg/kg*
0
12.5
25
50
100
150
PnTX-G
50 μg/kg*
0
6.25
12.5
25
50
75
OA 、DTX1 、DTX2 、PTX2
160 μg OA 当量/kg*
0
20
40
80
160
240
AZA1 、2、3
160 μg AZA1 当量/kg*
0
20
40
80
160
240
虾夷扇贝毒素
1000 μg YTX 当量/kg*
0
125
250
500
1000
1500
GYM 、PnTX-E 、PnTX-F
200 μg/kg*
0
25
50
100
200
300
SPX1
100 μg/kg*
0
12.5
25
50
100
150
PnTX-G
50 μg/kg*
0
6.25
12.5
25
50
75
实验部分
UPLC条件
系统：ACQUITY UPLC，运行时间：5.0 min，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×100 mm，1.7µm，柱温：40 ℃，样品温度：10 ℃，流动相A：6.7 mM氢氧化铵水溶液，流动相B：乙腈/水(9:1)含6.7 mM氢氧化铵，弱清洗液：水/乙腈(9:1)，强清洗液：乙腈/水(9:1)，
流速：0.6 ml/min，进样体积：5 μl。
时间（min）
流速（ml/min)
%A
%B
曲线
初值
0.6
70
30
N/A
0.5
0.6
70
30
6
3.5
0.6
10
90
6
4.0
0.6
10
90
6
4.1
0.6
70
30
6
5.0
0.6
70
30
6
MS条件
质谱仪：Xevo TQ-S，电离模式：ESI -/+，毛细管电压：3.0 kV，源温度：150 ℃，
脱溶剂气温度：500 ℃，脱溶剂气流量：800 l/h，MRM方法：见表2。
标准品制备
经认证的标准品OA、DTX1,2、PTX2、YTX、AZA1,2,3、环亚胺毒素(GYM)和13-去甲基Spirolide C (SPX1);江瑶毒素E(PnTX-E)、F(PnTX-F)和G(PnTX-G)的半纯化标准品;各种毒素的标准储液均采用甲醇制备;使用空白贻贝提取物并加入储液，绘制基质加标 (MMS)校准曲线;空白提取物按照样品提取方法进行制备。基质加标标准品的浓度分别为验证浓度的0、0.125、0.25、0.5、1.0和1.5倍(受管制毒素的验证浓度水平与允许浓度接近，如表1所示)。
样品提取
准备三份肉贝类全组织匀浆(1 g)，分别用3 ml甲醇进行提取。分别加入甲醇后涡旋混合。完成涡旋混合后，将提取物离心5 min，并转移上清液至10 ml容量瓶中。待第三次提取完成后(共9 ml)，加入适量甲醇至体积为10 ml。所得贝类提取原液先用0.2 μm膜过滤器过滤，然后再加标进行分析。为测定DTX3(OA、DTX1和2的酯类形式)的含量，还用2.5 M氢氧化钠对提取物进行了碱水解。再将碱性混合物在76 ℃下加热40 min，并冷却至室温，最后用2.5 M盐酸中和。
表2.各种亲脂性海洋生物毒素的MRM跃迁。
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单日验证
在单个实验室中进行单日验证研究，以便对UPLC/MS/MS方法进行评估。评估参数：线性、回收率、重复性、重现性、选择性和判断标准(CCα)。使用来自荷兰国家监测计划的空白贝类进行验证，包括贻贝、牡蛎、鸟蛤和剑蛏。为了确保验证所用的贝类为空白样品，在研究开始之前对这些贝类进行了分析以确定是否存在表2中所示的毒素。将七份不同的贝类样品(四份贻贝、一份牡蛎、一份鸟蛤和一份剑蛏)进行提取并加标，浓度分别为验证浓度的0.0、0.5、1.0和1.5倍。
结果与讨论
用甲醇稀释各个环亚胺类毒素的储液，用以通过IntelliStart™技术获取调谐参数。IntelliStart™能够自动进行仪器设置、化合物调谐和系统适用性检查，极大地简化了LC/MS系统的使用流程。各种毒素的m/z、锥孔电压和碰撞能量见表2。对于贵重的毒素标准品，可以用提取物加标代替原贝类组织匀浆，能节约10倍量的标准品。提取物加标这一方法因对所有相关毒素都具有很高的提取率(>90%)已经得到了验证。因此，导致假阴性结果的可 能性非常低。UPLC/MS/MS方法的开发基于之前由Gerssen等人所介绍的色谱法3。UPLC分离中除了原多甲藻酸受碱性条件的影响导致峰形较差外，对其它各类不同毒素都显示出较好的分离效果。Xevo TQ-S使得即使在法规要求的灵敏度水平下也能轻松检出色谱峰，各种毒素经5minUPLC分离得到的MRM色谱图如图2所示。
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图2.贻贝基质中1.0倍验证浓度的基质匹配标准品的MRM色谱图。
对于每种化合物，存在两个优化的MRM：一个用于确证,另一个用于定量。两个MRM结果之间的离子比率可作为分析标准之一，用于确定生物毒素是否确认为阳性。另一个监管标准是化合物最大残留量(MRL)。使用TargetLynx处理软件能够自动标记规定范围内的参数，当这些参数超过限制浓度时，分析人员能够非常容易地观察到。
各种毒素的检测灵敏度良好，甚至在浓度为验证浓度(管制毒素的规定浓度)的0.125倍时，仍可获得>3的信噪比。目前，部分受管制毒素的标准品仍无法获得( PTX1、45OH YTX、homoYTX和45OH homoYTX)。为测定这些毒素，根据现有毒素标准品(PTX2和YTX)的结构而研究得到的方法中，其它的非管制亲脂性毒素的MRM通道也包含在内，可利用该确证方法对其进行筛选，如图2所示。这些实验中确定的方法参数现已整合到Quanpedia数据库中，此系统的所有用户均可获取该方法操作规程。
单日验证结论
在单日验证中，对不同方法的性能参数进行了评估，如线性、回收率、重复性、重现性、选择性和CCα，如表3所示。
表3.单日验证试验结果。1包含ensis基质，2不含ensis基质，*重现性较差。
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对于所有毒素，基质加标的校准曲线在浓度范围(0.125~1.5×PL)内表现出良好线性(R2>0.990)。除PnTx-E回收率达到 122%外，其它各种毒素的回收率均介于91%~104%的范围内。如果采用甲醇制备提取物，先洗脱的化合物(保留时间为1.2 min)易产生甲酯，这也说明回收率较预期高但重复性较差(RSDr 23.1%)的原因。据观察，所有受管制毒素的重复性良好。而在非管制毒素中，只有PnTx-E和SPX1略高于预期值。对于SPX1，出现上述情况是由蛏类基质引起的，如果去除蛏类的结果并重新计算，则重复性结果符合要求，在含蛏类基质和不含蛏类基质的情况下，重复性分别为14.6%和12.8%。若要确定一份样品是否不符合规定，那么毒素浓度应≥判断限(CCα)。判断限是指在该浓度下能够以1-α或95%(α=5%)的概率推断样品超出允许的浓度，以此判定该样品是否符合规定。
