核转录分析
实验材料 cDNA0.45um 硝酸纤维素 尼龙膜 酵母 tRNA
试剂、试剂盒 PBS NP-40 裂解缓： 20XSSC LNaOH 甘油储存缓冲液 10X 转录缓冲液 核苷酸:ATPGTPCTP 200uCi「α32P]-UTP 10XSET 蛋占酶 K 无 RNase 的 DNase CaCI2 硫氰酸胍溶液 Tris-SDS 缓冲液 水饱和酚 氯仿异戊醇 无水乙醇 异丙醇 乙酸钠
仪器、耗材 紫外交联仪 D 狭缝印迹装 杂交箱
实验步骤
一材料与设备
1)cDNA
2)PBS
3)NP-40 裂解缓：0.5%NP-40,10mmol/LTris-HCl(pH7.4)，3 mmol/LMgCl2,10 mmol/LNaCl
4)20XSSC:3mol/LNaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠 (pH7)。
5)1mol/LNaOH
6) 甘油储存缓冲液：40% 甘油，50 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 0.5 mmol/L MgCl2, 0.lmmol/L EDTA
7)10X 转录缓冲液：l00 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，50 mmoI/LMgCl2，800 mmol/LKCllmmol/LEDTA,5 mmol/LDTT
8) 核苷酸:ATP,GTP，CTP
9)200uCi「α32P]-UTP:3000Ci/nmol。
10)10XSET;5%SDS，50 mmol/LEDTA，50 mmol/LTris-HCl(pH7,4)
11) 蛋占酶 K
12) 无 RNase 的 DNase:1Omg/mL
13)CaCI2：20 mmol/L
14) 硫氰酸胍溶液:4mol/L 硫氰酸胍，25 mmol/h 柠檬酸钠 (PH7.0),0.5%Sa rcosyl0.lmol/L2-疏基乙醇
15)Tris-SDS 缓冲液：Tris-HCl(PH7.2),1 mmol/LEDTA,0.1%SDS
16) 水饱和酚
17) 氯仿：异戊醇 (49:1)
18)0.45um 硝酸纤维素/尼龙膜，
19) 无水乙醇。
20) 异丙醇。
21) 酵母 tRNA:10 mg/ml。
22) 乙酸钠：2mol/L
23) 紫外交联仪 D
24) 狭缝印迹装
25) 杂交箱。
二、操作方法
下面每一步均在 0-4°C 进行
1）用冷的 PBS 洗 1X107-5X107 个细胞，1500 g 离心 5 min 收集细胞。
2) 去除上清，重悬细胞于 PBS 中，1500 g 离心 5 min 收集细胞。
3) 去除上清，加入 4 mlNP-40 裂解液，温和涡漩振荡, 冰上放置 10 min
4) 于 4℃,400 g 离心 10 min 沉淀细胞核。用 NP-40 裂解液洗涤一次.
5) 用 200ul 甘油缓冲液重悬沉淀，在显微镜下观察细胞裂解情况。
6) 分装，冻存于液氮中。
(二）核转录
1) 在无菌离心管中加入：3X107 个细胞核，35% 甘油，20ul1OX 转录缓冲液，4 mmol/LATP，GTP，CTP,200uCi(α32P]-UTP, 加蒸馏水至 200ul 于 26°C 温育 10 min
2) 加入 10ul_DNase1，10ul20 mmol/LCaCl2，于 26℃ 温育 lOmin，酶切核 DNA。
3) 加入 2ul 蛋白酶 K,25ul10×SET,5ul 酵母 tRNA，于 37℃ 温育 30 min。
4) 加入 550ul 硫氰酸胍溶液，90ul2mol/LNaAc，900ull 水饱和酚，180ul 氯仿/异戊醇，置于冰上 15 min。
5) 于 4℃,12000 g 离心 15 mm, 吸出水相。
6) 加入等体积异丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h。
7) 于 4℃12000 g 离心 15mim 用 300ul 硫氰酸胍溶液溶解沉淀，
8) 加入等体积异丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h,
9) 与 4℃12OOOg 离心 15mim, 用 70% 乙醇洗涤沉淀，用 1 mlTris-SDS 缓冲液溶解沉淀。总活性为 1X107-2X107cpm。
(三) 杂交分析
1) 在 100ul 的 25ug cDNA 探针或 50ug 线性质粒中加入 10% 体积的 lmol/LNaOH，使之变性。
2) 温育 15 min, 用 10 倍体积 6XSSC 中和。
3) 剪裁大小合适的硝酸纤维素/尼龙膜。用 0.4mol/LTris(PH7.0) 溶液将膜浸泡30 min, 而后将膜置于狭缝印迹装置上。
4) 将 1-5ug DNA 加至膜上，真空状态下于 80℃ 烘烤 2 h 或紫外交联 2 min。
5) 按常规方法进行预杂交，杂交。
6)X 射线片，显影分析。
注意事项
1) 洗膜的时间可根据实验确定. 上要考虑使用的探针的性质和力求莸得最小背景。
2) 细胞核的质量是核失控转录测定的关键。Dounce 匀浆器有助于制备不易被 NP40 裂解的细胞的核。
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实验室动态
