外泌体LncRNA帮助免疫细胞“叛变”----乳腺癌恶化新机制
外泌体是细胞间传递信号的媒介，直径在30-200nm，表面具有磷脂双分子层，内部具有丰富内含物的小囊泡，其内含物包括miRNA，环状RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前发表于Nature Cell Biology（影响因子：19）的文章为例，看一看外泌体中LncRNA的功能机制是如何研究的。
本篇文章由中山大学孙逸仙纪念医院宋尔卫、苏士成团队联合发表，首次揭示了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）通过分泌外泌体包裹的LncRNA调控肿瘤细胞糖代谢过程。为了找到外泌体中特有且高表达的LncRNA，本文作者借助外泌体LncRNA测序，对TAM及对照组细胞分泌的外泌体和相关细胞分别进行测序，找到了在外泌体中特异性高表达的LncRNA HISLA。通过外泌体与肿瘤细胞共培养、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通过抑制转录因子HIF-1a与PHD2蛋白结合来保证HIF-1a稳定性，即而维持肿瘤细胞有氧状态在HIF-1a信号的持续激活。反过来，处于显著无氧糖酵解状态的肿瘤细胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬细胞可显著上调巨噬细胞中HISLA表达，从而维持巨噬细胞来源的外泌体中HISLA的高丰度装载。
路线图：
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理解重点：
1.TAM是一种癌症相关巨噬细胞。在遇到癌症细胞后，职能发生180度大转变，成为癌细胞的“帮凶”，参与癌细胞促生长，迁移等过程。目前已发现，TAM中LncRNA能够以外泌体为媒介参与邻近癌细胞糖酵解的过程。本文想深入探究其中的机制。本文对照组：外周血中分离的一种单核巨噬细胞（MDM）。
2. HIF-1α是一种氧传感转录因子，能够决定葡萄糖的代谢途径是氧化还是糖酵解（无氧）。HIF-1α首先被PHD2羟基化，然后被降解。在本文中发现，LncRNA HISLA竞争性与PHD2结合，从而防止HIF-1α降解，达到增强肿瘤细胞有氧糖酵解。
3. 葡萄糖作为能量代谢的原料，主要通过有氧或无氧（又叫糖酵解）方式代谢产能。而肿瘤细胞在有氧条件下发生的糖酵解，产生大量中间产物：乳酸。
正文部分：
1.TAM促进有氧糖酵解和抑制乳腺癌细胞凋亡过程
借助免疫组化，通过GLUT3和CD63抗体标记乳腺癌组织，发现糖酵解与TAM相关。为了实验准确性，将每组8例样本量扩大到453例，从而得到了同样趋势，说明TAM与有氧糖酵解存在很大联系。通过体外共培养实验，进一步研究TAM调控肿瘤有氧糖酵解过程机理，发现乳腺癌细胞与从组织中分离的原代TAM共培养后，能够显著提高糖酵解水平（检测指标包括：细胞外酸化程度，葡萄糖消耗量和乳酸量，糖酵解途径蛋白marker）。同时，发生有氧糖酵解细胞的凋亡能力往往很低。
2.TAM激活HIF-1α参与促进有氧糖酵解和抑制细胞凋亡
已有研究报道HIF-1α可促进有氧糖酵解过程。作者将乳腺癌细胞与TAM共培养后，发现HIF-1α蛋白高表达，并且找到了高表达的原因在于其半衰期很长。同时，HIF-1α与有氧糖酵解水平呈正比（检测指标同一）。并且，HIF-1α抑制细胞凋亡。
3. 高通量测序筛选在TAM外泌体中高表达LncRNA
TAM主要研究领域是它们与其他类型细胞间传递遗传信息的机制，那外泌体是否是其中的媒介呢？为了解决这个问题，本文对乳腺癌细胞上清提取的外泌体进行了LncRNA高通量测序，测序组别为三组，分别是TAM与MDM（TAM的对照组细胞）提取的巨噬细胞，TAM与MDM细胞上清提取的外泌体，乳腺癌细胞与TAM共培养细胞与未做处理乳腺癌细胞（对照组）。在TAM外泌体组中找到88个与MDM外泌体相比差异上调的LncRNA。一切高通量手段都要通过低通量手段验证，作者借助LncRNA定量PCR检测了7个指标，其中有5个指标与测序结果一致。
4. TAM外泌体中LncRNA HISLA促进糖酵解
通过前期高通量测序，找到在三组中都高表达的LncRNA HISLA。将其敲除后，促进了外泌体的分泌。更有趣的是，在与TAM共培养前，抑制乳腺癌细胞中LncRNA HISLA基因能够抑制糖酵解。并通过RNA聚合酶II和III特异性抑制剂：α-amanitin证实，TAM外泌体未影响肿瘤细胞本身LncRNA转录过程，所以受体细胞中LncRNA HISLA增加主要是由于TAM外泌体中带来的。为了观察外泌体中LncRNA HISLA的形成轨迹，作者在基因上加上生物素标签，通过动态共聚焦显微镜发现LncRNA HISLA主要由核内体RAB7分泌而来。
5.肿瘤缺氧微环境中乳酸在TAM中上调LncRNA
通过生信软件预测LncRNA HISLA基因启动子区域与转录因子PU.1有典型结合位点。接着，借助ChIP qPCR实验证实两者是直接结合的。作者又发现LncRNA HISLA在TAM中的表达量远高于其他巨噬细胞MDM，已有研究表明MDM“策反”为TAM细胞期间，细胞中性粒细胞集落刺激因子和乳酸会差异表达，检测后发现导致LncRNA HISLA上调的主要原因是乳酸。更有趣的是，作者在TAM中发现HIF-1α表达量与LncRNA HISLA相关，并且LncRNA HISLA能够影响有氧糖酵解的生理表型。总的来说，乳酸在肿瘤缺氧微环境中起正反馈作用。
6. HISLA通过干扰PHD2与HIF-1α结合从而维持HIF-1α稳定
当乳腺癌细胞与TAM或TAM外泌体共培养时，细胞的羟甲基化和退化都收到了抑制，而此过程可能与HIF-1α的羟甲基化和退化有关。RNA pull down和RIP实验证实LncRNA HISLA与PHD2（HIF-1α的羟甲基化和退化指示蛋白）是直接结合的关系。Fish实验证实两者主要结合在细胞质。
7. LncRNA HISLA与乳腺癌糖代谢和化疗耐受相关
为验证本次研究成果与临床的相关性，作者以453个乳腺癌患者为样本，检测LncRNA HISLA表达量与肿瘤糖代谢关键基因（GLUT1，GLUT3，HK2）以及TAM的marker：CD68抗原。结果显示LncRNA HISLA在TAM中广泛表达，检出率为33%，同时表达量与TAM的浸润面积相关。重要的是，LncRNA HISLA在患者血液外泌体和组织样本中表达量相关，且都与TAM相关。表明在乳腺患者体内的TAM通过抑制LncRNA HISLA表达，从而增强肿瘤糖酵解过程。另外，作者将LncRNA HISLA表达情况与临床病理关联，发现高表达组与疾病的分级、分期、淋巴结转移及HER2亚型相关。并且表达量与GLUT3高表达，患者较差生存情况相关。总的来说，LncRNA HISLA在乳腺癌化疗耐药方面可作为理想的分子标志物。
总结：
本文首先通过外泌体LncRNA测序证实TAM通过分泌外泌体中LncRNA促进乳腺癌细胞糖酵解过程。借助分子间相互作用的机制实验，如RNA Pull Down，RIP，ChIP等证实LncRNA HISLA可通过结合PHD2蛋白从而维持HIF-1α稳定。同时，癌细胞分泌乳酸对TAM中LncRNA HISLA具有上调作用，从而形成了正反馈。临床大样本数据结果证实LncRNA HISLA在TAM中表达，并且与乳腺癌患者糖酵解、化疗效果差异和生存期长短相关。总的来说，本研究发现了肿瘤细胞分泌细胞外囊泡所携带LncRNA具有促进肿瘤糖酵解作用。
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