蛋白质SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳-1
【实验原理】
蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之则向负极移动，这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳（electrophoresis）。不同的蛋白质由于等电点不同，在电场中的泳动速率也不同，因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis,
SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺在引发剂（过硫酸铵）和增速剂（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）的氧化-还原作用下聚合而成的。凝胶的有效孔径与它的总浓度T％成反变关系，在高浓度时，凝胶孔径小，可以筛分分子量小的多肽；低浓度时，凝胶孔径大，则可筛分大分子蛋白质。工作时，凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，浓缩胶浓度低、孔径大，较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可被浓缩至一极窄的区带，以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。
SDS是一种阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreitol,
DTT）或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样本中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合,可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；然而，蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。因此，当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定，蛋白质纯度的分析，蛋白质浓度的检测，免疫印迹（Western Blot）的第一步，蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等。
【器材与试剂】
1. 微型凝胶电泳装置 （如：Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ型电泳仪），电泳电源，100℃沸水浴装置，Eppendorf管，微量注射器，带盖塑料染色盒，摇床。
2． 制胶试剂 丙烯酰胺（电泳级），N，N'-甲叉双丙烯酰胺，Tris碱，SDS，TEMED，过硫酸铵，DTT或α-巯基乙醇，甘油，溴酚蓝，甘氨酸，盐酸。
3. 染色/脱色试剂 考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸
4. 储存液
（1）30％丙烯酰胺储存液：29.2g丙烯酰胺，0.8g双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中，4℃保存1个月左右。（注意：未聚合的丙烯酰胺有神经毒性，须在通风橱内小心操作）。
（2）4 ×分离胶缓冲液100ml：75ml 2mol/L Tris-HCL（pH8.8），4ml 10% SDS，21ml蒸馏水，可在4℃存放数月。
（3）4×浓缩胶缓冲液100ml：50ml 1mol/L Tris-HCL(pH6.8)，4ml 10% SDS，46ml 蒸馏水，可在4℃存放数月。
