蛋白质SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳-2
（4）10% 过硫酸铵，5ml（0.5g过硫酸铵, 加5ml蒸馏水, 新鲜配置），-20℃保存一个月左右。
（5）10% （w/v）SDS，10g SDS加蒸馏水100ml, 室温保存。
（6）10% TEMED 0.1ml TEMED , 加0.9 ml蒸馏水。
（7） 2×上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS，
2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。
（8） 5×电泳缓冲液 （1L）：15.1g Tris碱，72g甘氨酸，50ml 10%SDS 加蒸馏水至1L，pH 8.3。
（9）考马斯亮蓝染色液：1.0g考马斯亮蓝R-250，450ml甲醇，100ml冰醋酸，450ml蒸馏水定容至 1000ml。
（10）考马斯亮蓝脱色液：100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水。
【实验方法与步骤】
1. 分离胶的制备
（1）凝胶中丙烯酰胺的百分比浓度（X％）与蛋白质的分辨范围
（2）分离胶的配方：
30％丙烯酰胺储存液、4 ×分离胶缓冲液、蒸馏水、10%过硫酸铵、TEMED
灌制分离胶。
（3）分离胶的灌制：
（1）按说明书组装好凝胶模具，对于Bio-Rad 微型凝胶系统，在上紧夹具之前，必须确保两块凝胶玻璃板和底部的封胶橡胶条紧密接触，避免漏胶。
（2）将30％丙烯酰胺储存液与4x分离胶缓冲液以及蒸馏水在一个小烧杯中混合。
（3）加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌混匀(凝胶会很快聚合，操作要迅速)。
（4）将凝胶溶液用吸管沿长玻板壁缓慢加入制胶模具中，避免产生气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm（距梳子齿约 0.5cm），接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约30min后，若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面，表明凝胶已聚合。
3. 浓缩胶的配方 5%的浓缩胶4ml， 用于Mini-Protein Ⅲ 型电泳槽
4. 浓缩胶的灌制
（1）向一侧倾斜制胶模具，吸掉覆盖在分离胶上的水；将30％丙烯酰胺储存液与4x浓缩胶缓冲液及蒸馏水在小烧杯内混合，加入过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀。
（2）将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶上面，直至前玻璃板的上缘。
（3）迅速将点样梳插入凝胶内，直至梳齿的底部与前玻璃板的上缘平齐。待凝胶聚合 (约30min) 后，小心拔出点样梳。
5. 预电泳 将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽，使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内；接通电源，上槽为负极，下槽为正极，80V预电泳3～5min。
6. 样品制备/上样/电泳 将20?滋l蛋白质样品与20?滋l 2×上样缓冲液，在Eppendorf管中混合，100℃加热3～5min；离心
5～10s，用微量注射器或移液器将样品（弃沉淀）缓慢滴入凝胶梳孔中；继续低电压（80V）电泳至样品进入分离胶，再将电压调至150V，保持恒压电泳，直至染料迁移至凝胶的底部（对于两块6cm×8cm×0.75mm的凝胶，约需50min），电泳结束。
小心撬开玻璃板，凝胶便贴在其中一块板上；切去浓缩胶和某一胶角（作标记）。
7. 染色与脱色 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。
凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。
【注意事项】
1. 凝胶不聚合的可能原因
（1）试剂质量差，应使用电泳级别的试剂。
（2）过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液。
（3）凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。
2． 上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。
3． 经过煮沸的样品虽然可以在-20℃保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20℃取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。
4． 注意避免电泳条带弯曲畸变：①“微笑”
现象（如图25－1所示），可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善.②“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。③“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服。④“晕轮”效应（holo
effect）多为加样过量所致。
5． 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。
6． 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测，须特别注意：1）已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量，并在同一块凝胶上电泳和染色。
