如何选择合适的液相色谱分离模式？
自 1903 年，俄国植物学家米哈伊尔•茨维特发明色谱算起，色谱已走过 100
余年历程。从最早正相色谱法，发展至今，诸多液相色谱分离模式：反相分离模式、亲水分离模式、离子分离模式、体积排阻分离模式和亲合分离模式等。因其具备多功能性和精确性，作为定性和定量的工具，液相色谱分析方法广泛应用于各行各业，如药物质量控制、食品营养物质和添加剂检测、环境挥发性有机物检测、法医毒物司法鉴定、临床质谱代谢物监控与高性能材料配方测定等。
了解和理解液相色谱分离模式，有助于液相色谱分析相关工作的开展和深入。
图1.色谱鼻祖
米哈伊尔•茨维特，俄国植物学家
液相色谱分离机理，本质上是分析物在流动相与固定相之间作用力差异。对于样品分析，需要综合组分性质与分离目的，选择合适的分离模式，便于获取最佳分析结果。对于分离模式，简介如下：
1.正相分离模式（Normal Phase）
茨维特发明色谱的植物色素分离实验，即采用正相分离模式。
机理：组分在极性固定相上的吸附/解吸附过程。
正相之意源自固定相极性大于流动相极性。
固定相以硅胶/氧化铝居多；流动相包括正己烷、石油醚、二氯甲烷、异丙醇等非极性和弱极性溶剂。
适合非极性与弱极性化合物分离、异构体分析、复杂样本分级以及特殊组分净化等。
正相分离模式下容易在极性填料表面产生死吸附，导致较差的重现性；目前主要用于手性拆分和制备色谱。
如脂溶性维生素D2分析与维生素D组分净化（GB 5009.82-2016 第四法食品中维生素D的测定）：
图2.维生素D2纯度分析-正相分离模式
2.反相分离模式（Reversed Phase）
机理：组分在疏水固定相与极性流动相之间分配差异（疏水相互作用）。
反相之意源自固定相极性小于流动相极性。
反相分离模式因其分辨率高、平衡速度快等优势，在所有液相分离模式中占据主要地位（约70%样品分析采用反相分离模式）。
图3.反相分离模式适用小分子、大分子和手性分子拆分
固定相以疏水功能基团（C18/C8）键合填料居多；流动相包括水相（纯水与缓冲液）、甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等极性和中等极性溶剂。
适合极性化合物（耐纯水反相填料，在高比例水相条件下，可实现令人满意的保留和基线分离）、中等极性、弱极性和部分非极性化合物分离分析。
注意：对于部分可离子化组分分析，可通过添加离子对试剂的
方式，进行反相分析。
图4.磷酸氯喹系统性实验谱图
3.亲水分离模式（HILIC）
机理：组分在流动相与固定相表面富水层之间分配差异。
固定相以极性基团键合填料居多；流动相包括水相（纯水与缓冲液）、甲醇、乙腈等极性与中等极性溶剂。
固定相与正相分离模式一致，流动相组成包含有机相和水相，故有含水正相的别称。又因分离模式中作用力较多，国内色谱理论界大拿至今不认可其作为单独分离模式划分。
亲水分离模式起步较晚，但因其适合极性化合物分离分析，随着生命科学迅速发展，应用范围逐步扩大，目前成为高极性化合物分析的重要手段。适用于极性化合物（如草甘膦、极性代谢物和糖链）、无机离子和亲水肽段等。
图5.亲水分离模式下6种极性化合物分离谱图
4. 其他分离模式
离子分离模式（Ion-Exchange），基于离子化合物与固定相离子化功能基团之间离子相互作用。适合离子化化合物的分析，如无机离子、氨基酸、有机酸、聚核苷酸和蛋白电荷异构体等。
注意：3价离子不适合用离子分离模式进行分析，因其与固定相作用力过强，出现不保留或强保留甚至不出峰的情况。
体积排阻分离模式（Size-Exclusion），利用不同分子量组分在填料内流经路径差异，实现分离。适用于低聚物组成、高分子化合物分子量测定与分布分析等。近年来在抗体药物单聚体与多聚体分析、PEG偶联分析等方面表现出卓越性能。
注意：该分离模式对于小分子之间的分析，分辨率极低，即使组分分子量差异在5倍以上。
亲合分离模式（Affinity），利用受体与配体之间可逆特异性结合（复杂作用力），实现分离。经典应用，即是利用Protein A与IgG的Fc区域之间的亲合作用，将Protein A键合在填料上，实现IgG类蛋白药物的纯化和浓度滴定。
亲合分离模式（Affinity），利用受体与配体之间可逆特异性结合（复杂作用力），实现分离。经典应用，即是利用Protein A与IgG的Fc区域之间的亲合作用，将Protein A键合在填料上，实现IgG类蛋白药物的纯化和浓度滴定。
离子分离模式、体积排阻分离模式（凝胶过滤）与亲合分离模式，流动相均为含盐缓冲液，可保证蛋白活性，特别适用于生物制药行业。
小 结
液相色谱分析中，会遇到各种样品组分，充分考虑分子性质和分析目的等方面信息，选择合适的分离模式。一般来讲，
对于小分子分析首选反相分离模式；
对于极性化合物分析，可首选高比例水相条件下的反相分离模式，其次亲水分离模式。
对于大分子分析，可选择的分离模式较多， 反相、离子、体积排阻、亲合与疏水等。
对于手性分子，尤其慎重选择填料和分离模式。
色谱包括液相色谱是一门经验科学，用心思考，善加总结，随着时间的积累，会加深对色谱的理解，综合考虑各方面因素，拿出最好的实验方案。
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