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细胞培养的基本方法-细胞分离技术（二）

2020.7.27

1.悬浮细胞
●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。
●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

2.贴壁细胞
●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。
●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。
●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。
●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

1.直接铺板方法
●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。
●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。
2.离心方法
●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
●以大约80x g离心2到3分钟。
●弃去上清。
●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

三、细胞的分化、衰老与死亡

1．细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞：形态结构，代谢，行为，功能等各不相同。追根溯源，这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以，通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段。例如，人体血细胞的产生和分化，这个过程在人的一生中一直持续着。

由旺盛生长不断分裂的细胞，转入分化，通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞，它们的基因表达和代谢活动各不相同。

2．细胞的衰老:体外细胞培养实验证明：

成纤维细胞：来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14--28次后衰老死亡,来自乌龟传代90--125次后衰老死亡。

细胞衰老过程中会发生一系列的变化，包括：蛋白质合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成份出现；同时，细胞核，线粒体，膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。

细胞衰老原因，尚无定论，出现过好几种理论与假说，其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。

3．细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象，常见的细胞死亡形式有3种：坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中，因为环境因素的突然变化或病原物的入侵，导致一部分细胞死去，称为细胞的病理死亡，或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡；细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于其它两种细胞死亡机理，如杀伤T细胞的细胞毒性作用。

还有一种情况，一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动（代谢、生长、发育、分化）的一个必要部分；似乎带有“牺牲局部，保全整体”的意味。这种情况下的细胞死亡，明显地受遗传控制，称为细胞凋亡。凋亡（Apoptosis）则是程序性的、正常的细胞死亡，是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程，无论从形态学、生物学还是生化的特征来说，都有明显的区别。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果将是可怕的：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征（HIV）、重症肝炎与退行性神经疾病，如老年性痴呆症（Alzheimer's disease）、帕金森氏症（Parkinson's disease）。因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。

细胞凋亡与坏死的区别

坏死

形态学特征-膜完整性丧失,胞浆和线粒体膨胀 ,全细胞裂解

生化特征-离子内环境失调,非能量依赖性的（被动过程，在4°C也可以发生）,随机消化DNA（电泳显示为DNA弥散状态）,Postlytic DNA断裂

生理学特征-影响群组细胞由非生理学因素引起（如补体攻击、代谢中毒、缺氧等）,被巨噬细胞吞噬, 周围有明显的炎症反应

凋亡

形态学特征-胞膜出芽，但保持完整,染色体聚集在核膜周边,胞浆收缩、细胞核凝集,最后细胞分裂为凋亡小体,Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加

生化特征--ATP依赖性的（主动过程，在4°C不能发生）,以核小体为单位剪切DNA（电泳显示为DNA ladder）,Prelytic DNA 断裂,线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素c、AIF）,Caspases级联活化,膜对称性改变（PS外翻）

生理学特征--只影响单个细胞 ,由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境改变等）,被临近细胞和巨噬细胞吞噬无炎症反应

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