双标记签的PCR扩增
试剂、试剂盒 溶液与缓冲液LoTEcDNA标签
实验步骤
实验方案 A 和 B
一、连接混合物的 PCR 扩增
1.加入 LoTE 使连接混合物的体积增至 20ul。
2.按 1% 浓度稀释连接混合物。
3.在 50ulPCR 反应中以 Iul 的 1% 稀释后的连接混合物作为模板：
4.最后，在 PCR 的反应中加入 1ul 稀释的连接混合物作为模板。
5.用下列条件来进行 PCR 扩增：
在进行 PCR 扩增后，在 12% 聚丙稀酰胺凝胶上电泳分析 IOul 的 PCR 混合物，用一个 IOul 的 ladder 作为标志，我们推荐用 Mini-PROTEANII 垂直电泳系统进行电泳 (BioRad)。
二、大量 PCR 的纯化（n=IOO)
1.在稀释的连接混合物大量地扩增之后（100XIOOul 的 PCR 反应)，在 100 ml 的烧杯中混合（混合体积为 10 ml 左右)。
2.50 ml 的 PB 缓冲液（QIAquickPCR 纯化试剂盒）于稀释的 PCR 混合物中，混匀。
3.向 16 个 QIAquick 柱中，每个加入 600ul。
4.在微量离心机中以 13000r/min 离心 45s。
5.移去过滤液并用同一柱重复 5 次，每次均加入稀释的 PCR 混合物 600ul。
6.在移去最后 1 次过滤液后，离心 1 次以去除所有的液体。
7.用 0.75 ml 缓冲液 PE 冲洗（QIAquickPCR 纯化试剂盒)。
8.以 13000r/min 在微量离心机中离心 45s。
9.弃去流过的液体，并再全速旋转 Imin 以去除所有的液体。
10.将此柱置入一干净的 1.5 ml 的 Eppendorf 试管中。
11.一个柱中加入 30ul 的洗脱缓冲液（QIAquickPCR 纯化试剂盒)。
12.在室温下放置 15 min。
13.以 13OOOr/min 在微量离心机中离心 Imin 以洗脱 DNA。
14.将 16 柱洗脱的 DNA 混合入一个试管中（总体积为 480ul)。
