核酸扩增引物设计的原则
引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为15～20个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的两条引物。除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：
一、引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的几率为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度(通常72℃)下不会形成稳定的杂合体。有时可在5'端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。
二、GC含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体刮两个引物中GC百分比含量应尽量相似，在已知扩增片段GC百分比含量宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳。
三、引物内部应避免形成明显的次级结构，尤其是形成发夹结构。
四、引物之间不应发生互补，特别是在引物3'端，即使无法避免，其3'端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primer dimer)。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。
另外，两条引物之间避免有同源序列，尤其连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点。同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其他序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其他位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。 五、引物3'端配对DNA聚合酶是在引物3'端添加单核苷酸，所以，引物3'端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。 引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。 人工合成的寡核苷酸引物最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长。一般情况下，不用的引物应保存在-20℃冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存1～2年。
