荧光定量PCR引物探针的设计总体原则
1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
2. 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
3. 扩增长度应不超过400bp，理想的扩增长度在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
4. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
5. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） 。
6. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
在原理上与引物设计是比较类似的。只是因为探针序列要求匹配度很高，所以对于探针的GC含量和Tm值都是有严格要求的，而且还要考虑到与上下游引物相匹配。假如你手头已经有了染料法的引物，然后想仍然使用这一对引物、在这一对引物对应的序列中间选一段作为探针可以吗？我们不建议这么做。因为你单独设计的上下游引物没问题，单独设计的探针看起来也没问题，但把引物与探针放在一起，就有可能出现参数不兼容的问题。所以还是三者放在一起设计才好。
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