Cell|棕榈酰化如何抑制通道脱敏——嘌呤受体P2X7结构解析
胞外ATP信号主要通过两大类膜蛋白：配体门控P2X受体例子通道和G蛋白耦连P2Y受体，其中P2X表达于多种真核细胞，介导多种生理过程，包括血小板激活、平滑肌收缩、突触传递、痛觉、炎症和凋亡【1】，是非常有潜力的药物靶点。哺乳动物的P2X共有7种亚单位，聚集形成同源和异源三聚的非选择性阳离子通道【2】。所有的亚单位都含有胞内N端和C端、组成孔道的两个跨膜（TM）螺旋、含有ATP结合位点的胞外结构域。ATP能够激活所有的P2X受体亚单位，但亲和力差异很大；不同亚单位其脱敏的速度也不同。而P2X7受体的ATP亲和力较低，完全缺乏脱敏现象【3】，而且P2X7在多种信号通路中作为细胞毒性受体，是P2X中唯一有此功能的亚单位。
P2X受体的胞内段被认为在受体的脱敏中有重要作用，但缺乏结构信息进行证明。尽管已经解析出多种P2X受体亚单位的结构，但都是N端和C端截短的结构，因为胞质结构域具有非常大的灵活性。目前为止，唯一包含P2X受体胞质结构域的结构研究是人源P2X3（hP2X3）受体【4】，揭示出N端和C端残基形成了一个动态结构域“胞质帽子（cytoplasmic cap）”，其稳定性决定了孔道开放构型的时间长度，从而决定受体脱敏的速率。与其他P2X亚单位不同，P2X7有2个额外的元件构成独特的胞质结构域：位于第2个跨膜结构域末端的胞质半胱氨酸富集区（C-cys），又叫C-cys锚定；C端的额外120个残基组成cytoplasmic ballast。其中cytoplasmic ballast被认为特异性参与调控P2X7受体的孔道扩张和启动细胞溶解信号转导【5】，但缺乏相关的结构信息证据。
2019年10月3日，来自美国俄勒冈健康与科学大学的Steven E. Mansoor在Cell杂志上发表文章Full-Length P2X7 Structures Reveal How PalmitoylationPrevents Channel Desensitization，解析了全长的鼠P2X7受体在apo和ATP结合两种状态下的冷冻电镜结构，并揭示出胞质元件C-cys锚定通过棕榈酰基团将孔道螺旋锚定在膜上，以防止受体脱敏；胞质元件cytoplasmic ballast具有独特的折叠，并包含锌离子复合物和鸟苷核苷酸结合位点。
研究人员表达了全长野生型鼠P2X7受体（rP2X7-WT），ATP能够激活rP2X7-WT，而且不会经历受体脱敏。解析得到rP2X7-WT在apo（关闭状态）和ATP结合（开放状态）两种的结构，分辨率分别达到2.9Å和3.3Å。rP2X7受体同样具有三聚体结构，每个单体有1个亲水性胞外结构域，2个跨膜螺旋（TM）和胞内段。与其他P2X亚单位不同，rP2X7有较大的胞内段，在apo和ATP结合两种状态中都可见。三个单体相互缠绕，每个单体从胞外域到跨膜域经历顺时针的相对旋转120度，随后从跨膜域到胞质域经历逆时针旋转120度。rP2X7中出现胞质帽子结构，在apo和ATP结合两种状态下都存在，因此是固定性结构；值得注意的是，胞质帽子结构被认为能够控制hP2X3受体的脱敏动力学，在hP2X3受体激活时动态性存在。rP2X7单体的N端组成C-cys锚定，C端组成cytoplasmicballast结构。同时，N端至少一个残基、C-cys锚定多个残基具有棕榈酰化修饰，验证了之前关于C-cys锚定通过加强rP2X7和膜磷脂脂筏的相互作用而调控受体功能的猜想。
没有ATP时，孔道关闭，rP2X7呈现出apo、关闭状态；ATP存在时，ATP占据正位结合口袋，rP2X7呈现出激动剂结合、开放状态。如何判定离子通道的开放与关闭状态？Apo状态下，TM2排列在rP2X7呈的孔腔上，残基Q332、V335、S339、S342朝向孔道；S339定义胞外边界，S342定义跨膜门控的胞内边界，其最大直径仅有0.1Å，不能容许阳离子通过，故判定apo为关闭状态。ATP结合的rP2X7其TM有持续的孔道，最小直径为2.5Å，足够水合Na+通过，故判定为离子通道开放。如何解释rP2X7受体对ATP的亲和力相对较低？通过对比rP2X7受体和hP2X3受体的结构信息发现两者在ATP结合的条件下并没有较大的差别：都有ATP的U形位姿及其占据正位结合口袋的特征；与ATP形成氢键作用和离子键作用的几乎所有氨基酸在两者中高度保守。但是，在apo状态下，hP2X3受体的ATP结合口袋其暴露的机率显著高于rP2X7，rP2X7的结合口袋有一个狭窄的通道，阻碍了ATP结合口袋的暴露，导致rP2X7对ATP的亲和力较低，但仍需要更多实验的验证。
rP2X7结构显示出特有的18氨基酸的C-cys区域，那么C-cys锚定具有什么功能？分析发现，apo状态下，C-cys锚定中至少4个半胱氨酸残基、1个丝氨酸和N端1个半胱氨酸具有棕榈酰化修饰。棕榈基团的空间排布确保了C-cys锚定和N端固定在膜上。研究人员推断这可以锁定胞质帽子的位置，限制TM2的移动，从而抑制胞质帽子的解聚，抑制受体的脱敏。敲除rP2X7的C-cys锚定段和突变可以棕榈酰化修饰的位点均能够导致受体的快速脱敏现象。同时，另一个重要的胞质元件cytoplasmic ballast具有非常新型的折叠方式，3个β片层形成1个反向平行的β片层，然后是8个长度不一的α螺旋，被形成的螺旋束分开；紧接β片层之后，多肽骨架指向受体的对称轴，其中每个单体的短螺旋（α9）间存在相互作用。进一步分析发现cytoplasmic ballast中含有Zn2+结合位点，对受体产生和运输过程起重要作用；含有一个对GDP、GTP高亲和力的结合位点。但无论是cytoplasmic ballast自身，还是Zn2+结合位点、鸟苷核苷酸结合位点，都对调控rP2X7受体的基本离子通道特性没有调控作用。
总的来说，研究首次解析了全长的P2X7的冷冻电镜结构，并揭示出P2X7胞质结构域的棕榈酰化修饰抑制通道脱敏的机制，为研究P2X受体及其胞质结构域的结构和功能提供了新的视角。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.017
参考文献
1. Burnstock, G., and Kennedy, C. (2011).P2X receptors in health and disease. Adv. Pharmacol. 61, 333–372.
2. Brake, A.J., Wagenbach, M.J., andJulius, D. (1994). New structural motif for ligand-gated ion channels definedby an ionotropic ATP receptor. Nature 371, 519–523.
3.Jarvis, M.F., and Khakh, B.S. (2009). ATP-gated P2X cation-channels. Neuro-pharmacology 56, 208–215.
4. Li,M., Wang, Y., Banerjee, R., Marinelli, F., Silberberg, S., Faraldo-Go ́ mez,J.D., Hattori, M., and Swartz, K.J. (2019). Molecular mechanisms of human P2X3receptor channel activation and modulation by divalent cation bound ATP. eLife 8,e47060.
5.Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J.C., and Greenfeder, S. (2005).Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATPchannel. Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 17–27.
