基于 AFLP 的转录表达谱分析（一）
实验方法原理
实验材料 Total RNA
试剂、试剂盒 链霉亲和素包被的磁珠洗涤缓冲液EDTA第一链缓冲液第二链缓冲液DTT4 dNTP 的混合物SuperScript II RNase HSTEXTris· ClRL缓冲液ATP PCR 缓冲液T4 多核苷酸激酶缓冲液加样染料硅烷黏合硅烷溶液变性聚丙烯酰胺凝胶TBE 分子质量标准物乙酸
仪器、耗材 微量离心管磁座PE-9600 热循环仪PCR 板测序凝胶系统磷屏
实验步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 在一个无 RNase 的微量离心管里混合 200 ug 总RNA、600 ng 5'-生物素化的 oligo-dT25 （5-生物素-dT25）和 300 ul 2× 结合缓冲液。用水调整体积到 600 ul。70°C 加热 5 min， 随后室温放置 15～20 min。
2. 用 0.5 ml 的 1× 结合缓冲液洗涤 150 ul 的链霉亲和素包被的磁珠（见下面步骤 4 关于技术和微量离心管的使用）。磁珠重悬于 50 ul 同样的缓冲液中。
3. 把这些洗过的磁珠，加入含 RNA 的混合物里（步骤 1）室温下轻轻搅动，温育 30 min。
4. 把微量离心管放在磁座上 30 s，然后吸掉尽可能多的上清，不要搅动磁珠或让它们干掉。把管子从磁座上拿下来，加入 0.5 ml 洗涤缓冲液，彻底混勻。重复 2 次以上，最后一次洗后吸掉上清。
5. 把磁珠重悬在 20 ul 12 mmol/L EDTA 中，70°C 加热 5 min 洗脱 poly （A）+ RNA。按步骤 4 用磁座收集磁珠，尽可能快地转移上清到一个新的无 RNase 的微量离心管里，不要吸取任何磁珠。重复一次，总共得到约 40 poly （A）+ RNA。 如果长期保存，加入 0.1 倍体积的 2 mol/L， pH 5.5 的乙酸钠，混匀，加入 3 倍体积的 100％ 乙醇，可以无限期地保存于 -20°C。回收时，最高速离心 5 min， 弃掉上清，在旋转蒸发仪上晾干，用双蒸水或缓冲液重悬到原来的体积。
6. 用 5 ul poly （A）+ RNA 溶液连同分子质量参照物一起进行琼脂糖凝胶电泳，检查分离的 poly （A）+ RNA 的产量（平均约 2 ug）和质量。电泳应该在大约 10 kb 以下出现很弱的拖尾（低分子质量）夹杂极少量的 rRNA。
7. 混合以下反应液，合成第一链 cDNA：
10 ul poly （A）+ RNA（约 0.5 ug）
0.5 ul 700 ng/ul 5-生物素-dT25（逆转录引物）
2 ul H2O
4 ul 5× 第一链缓冲液
2 ul 0.1 mol/L DTT
1 ul 10 mmol/L dNTP
0.5 ul 200 U/ul 的 SuperSript II （最后加）
42°C 温育 2 h。
8. 混合以下反应物，进行第二链合成：
20 ul 第一链 cDNA 合成混合物（来自步骤7）
16 ul 5× 第二链缓冲液
1.5 ul 10 mmol/L dNTP
3 ul 0.1 mol/L DTT
7.5 U E.coli DNA 连接酶
25 U E.coli DNA 聚合酶 I
0.8 U RNaseH
加水到 80 ul。
12°C 温育 1 h，然后 22°C 再温育 1 h。用琼脂糖凝胶检查 cDNA 的质量和产量。
9. 用 100 ml 的 2×STEX （技术方面见步骤 4）洗涤 25× 链霉亲和素包被的磁珠。重悬在 80 ul 的 2×STEX 中。
10. 把磁珠悬液加入 cDNA 混合物里，室温轻轻搅动，温育 30 min。
11. 用磁座收集磁珠（步骤4），用 100 ul 的 1×STEX 洗一次，转移到一个新的微量离心管里。用 1×STEX 再洗两次，最后把磁珠重悬在 50 ul 的 H2O 或 10 mmol/L的 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA。
12. 混合下面的反应物：
20 ul cDNA 样本（一般 100～200 ng）
10 U TaqI 限制性内切核酸酶
8 ul 5×RL缓冲液
用水调整体积到 40 ul。
65°C 保温 1 h。
13. 加入如下成分：
10 U MseI 限制性内切核酸酶
2 ul 5× RL 缓冲液
用水调整体积到 50 ul。
37°C 温育 1 h。
14. 混合 8.5 （1500 pmol） 的长链和 8 （1500 pmol）短链用于制备Taql接头。用水调整体积到30 ul。
15. 混合 8.5 ug（1500 pmol）的长链和 8 ug （1500 pmol）短链用于制备 TaqI 接头。用水调整体积到 30 ul。
16. 用 TagI 和 MseI 消化的 cDNA 片段（步骤 12、13）中加入下述试剂：
1 ul 各种接头（各 50 pmol； 步骤 14、15）
1 ul 10 mmol/L ATP
2 ul 5× RL 缓冲液
10 ul H2O
37°C 温育 1 h。加入 1 U T4 DNA 连接酶，37°C温育 2 h。
17. 用 Tris-HCl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 10 倍稀释一小份（2～5 ul）模板混合物（步骤16)。准备如下扩增反应：
5.0 ul 1：10稀释的模板混合物
1.5 ul 各 8 pmol/ul 的 AFLP＋0 （非选择性）引物
2.0 ul 5 mmol/L dNTP （每种 dNTP 的终浓度为 0.2 mmol/L）
5 ul 10× PCR缓冲液
1 U Ampli Taq DNA 聚合酶
加水到 50 ul。
18. 在 PE-9600 热循环仪上运行下面的温度循环进行扩增：
20 轮：
30 s 94°C（变性）
60 s 65°C（引物复性）
60 s 72°C （引物延伸）。
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