PCR技术应用--基因工程的应用
基因融合
通过 PCR 反应可以比较容易地将两个不同的基因融合在一起。在两个 PCR 扩增体系中,两对引物分别有其中之一在其5'末端和3'末端引物带上一段互补的序列。混合两种 PCR 扩增产物,经变性和复性,两组 PCR 产物通过互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在 PCR 条件下发生延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。
基因定量
采用 PCR 技术可以定量监测标本中靶基因的拷贝数。这在研究基因的扩增等方面具有重要意义。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于同一个试管中进行 PCR 扩增。电泳分离后呈两条区带,比较两条区带的丰度;或在引物5'端标记上放射性核素,通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。利用差示 PCR 还可以对模板 DNA(或 RNA)的含量进行测定,在一系列 PCR 反应中,分别加入待测模板 DNA 和参照 DNA片段。参照 DNA 片段基本上按待测 DNA 的方式进行构建,只是在其基因上增加了一小段内部连接顺序,这样使得两种 DNA 片段的 PCR 产物可在凝胶电泳上分开。由于这两种不同的 DNA 片段可以在同一种寡核苷酸引物的作用下同步扩增,因此可以避免因使用不同的引物所引起的可能误差。这两种扩增产物的相对量就反映了在起始反应混合物中的目的 DNA 和参照 DNA 的相对浓度。RQ-PCR 技术是在常规 PCR 基础上加入荧光染料或荧光标记探针然后通过荧光定量 PCR 仪检测 PCR 过程中荧光强度的变化,达到对样品靶序列进行定量检测的目的。
引入基因点突变
PCR 技术十分容易用于基因定位诱变。利用寡核苷酸引物可在扩增 DNA 片段末端引入附加序列,或造成碱基的取代、缺失和插入。设计引物时应使与模板不配对的碱基安置在引物中间或是5'端,在不配对碱基的3'端必有15个以上配对碱基。PCR 的引物通常总是在扩增 DNA 片段的两端,但有时需要诱变的部分在片段的中间,这时可在 DNA 片段中间设置引物,引入变异,然后在变异位点外侧再用引物延伸,此称为嵌套式 PCR(nested PCR)。
其他
还可以鉴定与调控蛋白结合的 DNA 序列;转座子插入位点的绘图;检测基因的修饰;合成基因的构建以及构建克隆或表达载体等。
