血红素的提取测定方法
提取原理
血红蛋白在pH低于3.0时，血红素与珠蛋白的结合最为疏松，此时加入有机溶剂丙酮，使珠蛋白变性凝固，血红素则溶于丙酮中，在丙酮中加入适量的鞣酸或乙酸钠，可得到较纯的血红素结晶，然后用乙醇一乙醚洗涤，可得到精制血红素。血红素在波长385处有最大吸收，可直接进行比色测定。
试剂器材
1、试剂0.5%～1%柠檬酸三钠；生理盐水；95%乙醇；氯仿；0.15%亚硫酸氢钠；丙酮；0.1 mol/L NaOH；1 mol/L盐酸，血红素标准品。
2、器材离心机；真空浓缩装置；真空干燥机；分光光度计；新鲜猪血。
操作步骤
1、血红素制备与纯化
（1）新鲜猪血抗凝新鲜猪血，加入0.5%～1%柠檬酸三钠溶液（V/V=10 : 1），搅拌均匀，得新鲜抗凝猪血。
（2）分离红细胞取抗凝猪血10mL于离心管中，以3000r/min离心15min，倾出上清液（血浆），收集红细胞，用0.9% NaCl洗涤2次。洗涤方法为：用适量生理盐水悬浮红细胞，搅拌均匀，离心，收集红细胞沉淀，测定红细胞体积（mL）。
（3）溶血加入相当于红细胞体积1倍的去离子水、0.25倍95%乙醇，搅拌30min，红细胞吸水胀裂，血红蛋白释放出来。
（4）分离血红蛋 白溶血后加人红细胞体积0.15倍的氯仿，搅拌15min，离心，得到含血红蛋白的沉淀物。
（5）分离血红素 上述沉淀物中加入相等于红细胞体积的0.15%亚硫酸氢钠溶液，使其溶解，然后加入红细胞体积4倍的丙酮，搅拌均匀，用0.1 mol/L盐酸溶液调节pH为3，使珠蛋白与血红素充分分离（抽提时间为10 min以上），然后4000r/min离心10 min，弃沉淀，上清液即为血红素丙酮溶液。
（6）血红素纯化 血红素丙酮溶液采用真空浓缩并回收丙酮，浓缩物用0.1 mol/L NaOH溶解，3 000 r/min离心10 min，收集上清液。用0.1 mol/L盐酸调pH至4～5，沉淀血红素，收集沉淀，用水洗沉淀至中性，50℃真空干燥至恒重，得血红素。测定血红素制品的重量（mg）。
2、血红素测定
以0.1 mol/L NaOH分别溶解血红素标准品和提取得到的血红素制品，调整至适宜浓度，于385nm处测定吸光度，计算样品中血红素提取率及纯度。
