T7RNA聚合酶系统基因表达实验（一）
本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体T7 RNA聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于T7 RNA聚合酶启动子（PT7）的控制下。在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶转录。这种转染方案适用于分析的目的，因为不需要构建新的重组病毒，所以比较简单。
对于大规模的工作，PT7 操纵的基因可以通过同源重组插入另一个重组痘苗病毒中，使之与 vTF7-3 共同感染悬浮细胞（见「两种重组痘苗病毒共感染细胞」）或感染 OST7-1 细胞(可以持续表达 T7 RNA 聚合酶的稳定细胞系；见「单病毒感染OST7-1细胞」）。表达的蛋白质可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分析鉴定，用「离子交换层析实验」描述的方法纯化。
对痘苗病毒/T7 RNA聚合酶杂交表达系统有几种创新的方法，其中的一个新的改进是VOTE诱导的表达系统，它不需要应用两种重组病毒或特殊细胞系（见「利用VOTE系统」）。
两种重组痘苗病毒共感染细胞
| 实验方法原理 | 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系统基因表达实验」中「重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染」）的重组质粒，通过同源重组可整合到痘苗病毒中,并制备重组病毒储液。将此病毒储液与 vTF7-3 共同感染贴壁或悬浮细胞，在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶转录，并在感染细胞的细胞质完成翻译。随后进行分析鉴定或纯化蛋白质。 此共感染方案适用于大量生产蛋白质，基于这种目的，常使用悬浮培养的细胞（如 Vero 或 HeLa S3）。 |
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| 实验材料 | vTF 7-3 痘苗病毒储液含有 pT7 控制的外源基因的重组病毒储液贴壁培养的单层 CV-1 细胞／转瓶悬浮培养的 HeLa S3 |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 对于贴壁培养的单层细胞： 1.1 感染 CV-1 贴壁单层细胞：在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培养基将 5 × 105 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养，直至细胞几乎汇片生长（一般过夜）。 1.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶，涡旋混匀，温育 30 min，每隔 5～10 min 晃动一次。 MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质表达。 如果还有团状物，将其冷却到 0℃，冰上超声 30 s。可以重复几次超声，但超声的间隔中样品应当置冰上冷却（见「痘苗病毒系统基因表达实验」中「重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染」）。 1.3 将两种胰酶消化的病毒储液混合。 1.4 将胰酶处理后的病毒用 MEM-2.5 培养基稀释至 4 × 107 pfu/ml (每种病毒为 2 × 107 pfu/ml）。 1.5 吸出培养基，用 0.5 ml 的病毒混合液感染 6 孔板中每孔的细胞，温育 1～2 h，每隔 15～30 min 晃动一次。 1.6 加入 2 ml 的 DMEM-10 培养。根据使用的方法，在感染后 5～24 h 分析基因表达。如果纯化蛋白质，在感染 2～3 天后收获细胞。 注：尽管在感染后数小时就可以检测基因表达，但一般在病毒感染的晚期进行免疫沉淀、免疫印迹或 Northern 印迹分析，因为这时 T7 控制的基因产物积聚到最高水平。早期分析一般检测表达蛋白的生物学活性。 2. 对于悬浮培养的细胞： 2.1 感染 HeLa S3 悬浮细胞：在病毒感染前，用血球计数器对细胞进行计数, 在室温下 1800 g 离心 5 min，弃上清。用转瓶 MEM-5 培养基重悬细胞至 2 × 107细胞/ml，将其转移到较小的无菌组织培养瓶或 Erlenmeyer 瓶中。 2.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶，涡旋混匀，温育 30 min, 每隔 5～10 min 晃动一次。 MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质表达。 如果还有团状物，将其冷却到 0℃, 冰上超声 30 s。可以重复几次超声，但超声的间隔中样品应当置冰上冷却（见「痘苗病毒系统基因表达实验」中「重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染」）。 2.3 将两种胰酶消化的病毒储液混合。 2.4 将胰酶消化病毒混合物加入浓缩细胞中，37℃ 悬浮培养。 2.5 将感染后的细胞加入到大的旋转培养瓶中，用转瓶 MEM-5 培养基将其稀释至 5× 105 细胞/ml，37℃ 悬浮培养 1～3 天。 2.6 收获细胞，分析或纯化表达蛋白（见步骤 1.6 注释）。 |
| 注意事项 | 1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，除非有特殊说明。 2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。 |
