T7RNA聚合酶系统基因表达实验（三）
| 实验方法原理 | VOTE是最近发展的痘苗病毒/T7 RNA聚合酶混合表达系统，将外源基因克隆到质粒 pVOTE. 1或 pVOTE. 2 中，通过同源重组将其整合到痘苗病毒 vT7lacOI 基因组中，制备重组病毒储液。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）存在的条件下，用重组病毒感染细胞，外源基因被高效的T7 RNA聚合酶转录，并在感染细胞的细胞质完成翻译。图 16.16.3 说明了这一系统。 |
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| 实验材料 | 痘苗病毒 vT7lacOI含有外源基因的 DNA PVOTE. 1 或 pVOTE. 2贴壁培养的单层 CV-1 或 BS-C-1 细胞用于表达蛋白的细胞 |
| 试剂、试剂盒 | |
| 实验步骤 | 1. PCR 扩增外源基因可读框，将含有翻译起始密码子作为 NcoI（CCAT- GG）位点一部分克隆到 pVOTE. 1 中或作为 NcoI（CATATG）位点的一部分克隆到 pVOTE. 2 中。 PCR 产物的另一末端应该与 MCS（XhoI SacI, SmacI EcoRI, PstIl, SalI 或 BamHI）中单一的限制酶位点兼容。 2. 选用限制性内切核酸酶消化 PCR 产物、pVOTE. 1 和 pVOTE. 2 载体，连接载体与 PCR 产物。 3. 制备 vT7lacOI 病毒储液，并用该储液感染 CV-1 或其他细胞系。 4. 将来源于 pVOTE. 1 或 pVOTE. 2 载体（步骤 1）的重组质粒转染 vT7lacOI 感染的细胞（步骤 3），收获病毒。 5. 通过表达 XGPRT 筛选重组病毒，噬斑纯化病毒。 6. 制备噬斑纯化的病毒储液。 7. 用 10 pfu/细胞的重组病毒感染贴壁或悬浮培养的 HeLa 细胞或其他细胞，开始感染时在培养基中加入 5 μmol/L～2 mmol/L 的 IPTG。 8. 用标准方法鉴定表达的蛋白质。 收起 |
| 注意事项 | 1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，除非有特殊说明。 2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。 3. 为了提高表达效率，翻译起始密码子必须紧邻脑心肌炎病毒的核糖体进入位点。 |
