雷帕霉素生物活性及实验方法
雷帕霉素是一种特异性的mTOR抑制剂，IC50为0.1nM
In Vitro：雷帕霉素抑制HEK293细胞内源性mTOR活性，IC50为0.1 nM，比iRap和AP21967更有效，IC50分别为5 nM和10 nM [1]。 雷帕霉素通过诱导自噬发挥其对恶性神经胶质瘤细胞的抗肿瘤作用，并且表明在恶性神经胶质瘤细胞中PI3K / Akt信号传导途径的破坏可以极大地增强mTOR抑制剂的有效性。 雷帕霉素以剂量依赖性方式抑制所有三种细胞系中的细胞活力，但它们的敏感性变化。 T98G，U87-MG和U373-MG细胞的IC50水平分别为2 nM，1μM和>25μM[3]。
In Vivo：雷帕霉素（i.p，1.5 mg / kg）治疗几乎完全可以防止7天和14天跖肌重量和纤维大小的肥大增加[4]。 每天用雷帕霉素（2mg / kg体重，腹膜内注射）治疗WT或LS / +小鼠4周，然后每周注射相同剂量另外4周。 雷帕霉素处理的LS / +小鼠心脏的异常胎儿基因表达谱显着逆转[5]。
Kinase Assay：将HEK293细胞以每孔2-2.5×10
5个细胞接种于12孔板中，仅在DMEM中血清饥饿24小时。
将细胞模拟处理或用雷帕霉素（0.05-50nM），iRap（0.5-500nM）或AP21967（0.5-500nM）在37℃处理15分钟。
在37℃下将血清加至终浓度为20％，持续30分钟。 裂解细胞，通过SDS-PAGE分离细胞裂解物。
将分离的蛋白质转移至PVDF膜，并用针对p70 S6激酶的Thr389的磷酸特异性一抗进行免疫印迹。
使用ImageQuant和KaleidaGraph [1]分析数据。
MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。
Cell Assay：HL-60，NB4，U937，KG-1和K562细胞常规传代于RPMI-1640中，补充有10％热灭活的FBS，2 mM L-谷氨酰胺，50 U / mL青霉素和50μg/ mL链霉素。 在37°C下，5％CO2加湿的气氛。 对于实验，通过离心收获指数生长的细胞，并重悬于含有10％FBS的新鲜培养基中。 在各种浓度的DMSO或1μMATRA存在下，在BD Falcon六孔板中以2×10 5 / mL的初始细胞密度接种细胞。 在分化剂之前20分钟加入雷帕霉素（20nM）。 在第2天，向每个孔中加入0.3mL新鲜培养基。 通过台盼蓝排除法测定活细胞，并使用血细胞计数器进行定量[2]。
MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。
Animal Administration：大鼠[4]
将雌性Sprague-Dawley大鼠（250-275g），成年雌性SD大鼠（225-250g）随机分配至治疗组或媒介物组，使得每组的平均起始体重相等。药物治疗开始于手术当天或14天停药后重新加载的第一天。雷帕霉素每天一次通过腹膜内注射以1.5mg
/ kg的剂量递送，溶解在2％羧甲基纤维素中。 CsA每天一次通过皮下注射以15mg / kg的剂量递送，溶于10％甲醇和橄榄油中。
FK506每天一次通过皮下注射以3mg / kg的剂量递送，溶于10％乙醇，10％的cremophor和盐水中。
小鼠[5]
将雷帕霉素以20mg / mL的浓度溶解在乙醇中，过滤灭菌，以1mg /
mL的浓度重悬浮于载体（0.25％PEG，0.25％吐温-80）中，并腹膜内注射。 （2mg /
kg体重），每天持续4周或每天持续4周，然后每周注射另外4周。注射开始于8周（肥大发作前）或12周（指示确定肥大后），并在治疗4周后或治疗8周后评估小鼠，详见结果和图例。
。作为对照，WT和LS / +小鼠仅用载体处理。
MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
