CV1000活细胞工作站在HCV病毒颗粒的内吞作用研究中的应用
一、实验背景
丙型肝炎病毒（HCV）是引起丙型肝炎的罪魁祸首，全球有 1.3 亿人慢性感染HCV并逐步 发展成肝硬化和肝癌，但就其致病机理却并不像其他肝炎病毒（如 HBV）一样清晰，在HCV进入肝细胞的过程中，一系列的受体识别和相互作用的参与其中，还包括由网格蛋白(clathrin)参与的内吞作用，但目前除了受体之外，感染性 HCV 入侵的所需的其他的细胞分子还知之甚少。
二、实验方法
通过筛选了包含靶向标记 140 个细胞膜流通蛋白 siRNA 的文库， 以期找到 HCV 假病毒颗粒进入和感染性病毒粒子成熟所需要的宿主基因。
使用单颗粒追踪技术和Yokogawa转盘式激光共聚焦活细胞成像系统来分析高感染性荧光 HCV 病毒颗粒在内吞作用过程中和细胞因子的相互作用。
首先我们用膜透过性亲脂染料 DiD 和 DiI 标记 HCV 病毒颗粒，这两种染料已经证明可用来病毒示踪，但并不影响病毒的感染活性。
三、实验结果
在实验过程中，16个宿主基因已被验证参与了网格蛋白介导的内吞作用，肌动蛋白的聚合，受体分选，内质网酸化等过程中。
1. 病毒与肌动蛋白的共定位以及动态变化
图1
很多病毒的内化作用都和肌动蛋白富集的丝状伪足或退缩伪足到细胞体的逆向运输有关，那么我们就检测了荧光标记的 HCV 病毒颗粒和肌动蛋白的相互作用情况；如图1所示，红色 荧光为燃料标记的病毒颗粒，绿色为瞬时表达的肌动蛋白-GFP 融合蛋白，病毒首先在 4℃ 与细胞孵育 1 小时，接着转移至 37℃开启病毒的进入过程，之后分别在 30Min(A)和60min(B)，固定细胞，观察荧光的定位，可见在病毒的进入过程中，和丝状伪足(A)以及细胞膜的肌动蛋白骨架(B)紧密结合。
图2
接着，每 5 秒曝光一次，来跟踪 病毒在细胞内的运动状态，如图2 所示，约有19.9%的病毒沿着丝状伪足运动-A，27.4%随机运动-B，7.5% 的病毒颗粒运动方向和肌动蛋 白的聚合相关（C 白色箭头指示 丝状肌动蛋白的成核位置）且肌 动蛋白的聚合引起病毒颗粒的位移-D。在检测过程中，约有 43.8±7.5%的病毒颗粒并没有发生位移。E 图为病毒颗粒运 动的速度检测，平均速度为 1.8um/min。F为对两种运动-主动运输运动（A）和随机运动（B）均方位移的测定。
2. 细胞松弛素 D 抑制肌动蛋白聚合作用后病毒颗粒的运动状态
为了验证这种位移确为肌动蛋白的聚合做特异性引发的，科研人员又设计了有一组实验，用 细胞松弛素 D 来抑制肌动蛋白的聚合，以期观察肌动蛋白聚合阻断情况下病毒颗粒的运动 变化。实验结果果然与预料的相符，如图3，感染后 48 小时对进入细胞的病毒颗粒数量和细胞松弛素 D 的浓度呈现反向相关的剂量效应—A，接着表达 actin-GFP 的肝细胞和红色荧光标记的病毒孵育后，置于激光共聚焦显微镜下动态观察病毒颗粒的运动状况--B，无抑制剂情况 下，病毒颗粒如上面实验结果一样沿着丝状肌动蛋白聚合方向运动，在拍摄过程中加入细胞 松弛素 D以抑制肌动蛋白的聚合，病毒颗粒的运动停滞不前---C,D。
图3
3. 网格蛋白参与的内吞体在病毒内化作用中的作用
用同样的试验方法和材料，研究者接着检测了 HCV 病毒颗粒在感染 0 分时和网格蛋白共定位，且在感染时相中，和 E3 泛素连接---c-Cbl 共定位，这些实验结果都指示着 HCV 病毒 颗粒的内化与内吞作用相关。
总结：这是一篇发表于 2009 年的关于 HCV 病毒颗粒内吞作用的机理研究，文章结合了siRNA 结果和活细胞成像结果，第一次动态的揭示了 HCV 病毒颗粒的内吞过程。随着对微观世界知识探知的好奇增长，荧光标记技术和活细胞成像技术使得这一切梦想成真。但技术的发展并没有停止，这篇文章中使用的单转盘激光共聚焦扫描技术，现已被双转盘技术所取代，YOKOGAWA生产的双转盘扫描头使得高速、动态、清晰的成像效果再次提高到了前所未有的高度，Cell Voyager 1000 是目前 YOKOGAWA 公司生产的最高端双转盘扫描头的唯一代表，注重于人性化的设计，高质量的成像，希望用世界最高端的技术为科研工作者提供最真实，可靠的实验数据。
参考文献
Coller KE, et al. (2009) RNA interference and single particle tracking analysis of
hepatitis C virus endocytosis. (Translated from eng) PLoS Pathog 5(12):e1000702 (in eng).
