活细胞荧光成像的新型标记法及其在STED中的应用（二）
图5.EGFR在细胞中转运的实时记录。（a）示意图，用于解释如何利用FAPL探针来实时追踪EGFR相关的细胞膜转运过程。（b）COS7细胞中表达的EGFR用DRBG-488标记（绿色），溶酶体用lysosometracker（红色）标记。（c）对表达SNAP-EGFR–CFP的MDCK细胞进行共聚焦实时成像。SNAP-EGFR-CFP用DRBG-488进行标记。在5min时加入了EGF刺激细胞，每个1min拍摄一次荧光图像。相对于CFP的成像，DRBG-488能够更清楚的记录EGF刺激之后囊泡的形成及其在溶酶体里的聚集。
为了能够消除自发荧光，更清楚的对更深的组织甚至是活体动物进行荧光成像，科学家们对近红外染料的研发从未止步过[16]。Johnsson等科学家最近基于sillion-rhodamine荧光基团，推出了一款新的细胞膜通透性的近红外染料（SiR）[17]。在未与SNAP-tag等标签结合之前，成聚集状或者与疏水结构非特异性结合的SiR会处于不发荧光的螺甾内酯状态；一旦与标签蛋白结合，SiR将处于两性离子状态，而发出很强的荧光（图6）。将SNAP-tag的底物标记SiR便形成了SiR-SNAP。因此，利用SiR-SNAP对活细胞进行标记时，背景荧光非常低，从而免除了清洗步骤，实现实时的荧光探测。同时由于其光谱的近红外特性，可以应用于深层组织，如大脑切片的成像（图7）。
图6. （A）SiR的两种形式。（B）SiR的激发光谱（蓝色虚线）和发射光谱（红色实线）。
图7. SiR-SNAP标记的大鼠脑片。a,子宫内原位电转示意图。红色方框内的区域即为b图中进行荧光成像的区域。b,通过子宫内原位电转将SNAP和GFP的质粒以1:1的比例导入到E16期的神经元前体细胞中。对E19期的大鼠脑组织进行了切片并用SiR-SNAP和Hoechst进行了染色。c,对b图中黄色方框区域的放大，GFP和SiR-SNAP的良好共定位验证了SiR-SNAP标记的特异性。
SiR在STED超高分辨率显微成像中的应用
Johnsson及其同事也将SiR-SNAP应用到STED超高分辨率显微镜对中心体蛋白Cep41的活细胞成像中[17]（图8）。共聚焦图像显示SiR-SNAP标记的U2OS细胞中的Cep41-SNAP在微管及中心体中均有定位（图8b）。STED超高分辨率显微镜发现SNAP-Cep41以环形排列在中心体上，该环形的直径为175±13nm （n=7），这说明Cep41定位于微管形成的中心粒壁上（图8d）。Z轴方向成像显示由SNAP-Cep41形成的结构大约长440±28nm （n=16），这与已经报道的中心粒的长度是一致的，这说明Cep41形成的环形结构贯穿于整个中心粒。
图8. U2OS活细胞中Cep41的共聚焦及STED成像。a, 中心体结构示意图。b,SiR-SNAP标记的Cep41和Hoechest 33342标记的细胞核的双色共聚焦图像。c,结合于微管的Cep41的共聚焦及STED荧光图像。d,位于中心体的Cep41的共聚焦及STED荧光图像。标尺，500nm。
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