细胞培养污染拯救及预防方法-2
2、支原体污染的检测
（1）相差显微镜观察
直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
（2）荧光染色法观察
用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。
（3）电镜检测
若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。
支原体扫描电镜图片
（4）培养检测
将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
3 、病毒的检测
1) 应用电镜技术快速诊断动物病毒病
冠状病毒电镜图
2) 逆转录_聚合酶链反应RT_PCR检测病毒
（三）污染的清除
培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。
若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。
一、细菌和真菌的清除
1、使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。
预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。
二、支原体的清除
１、用MRA处理
用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康，效果好．
2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法
细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤
其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。
如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。
3、药物辅助加温处理
先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。
４、使用支原体特异性血清
用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。
（四）、污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。
一般预防可从以下几方面着手：
1、添加抗生素
2、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。
操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
3、从操作者做起
（1）进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
（3）操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。
4、防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。
在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。
5、无菌室的彻底消毒
1） 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室；
。
2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
-
产品技术
