Nature子刊m6A修饰携手miRNA揭示脱氧胆酸在胆囊癌中作...-1
Nature子刊m6A修饰携手miRNA揭示脱氧胆酸在胆囊癌中作用机制的应用
miRNAs是一类长约22nt的单链小RNA，已经成为多种疾病的关键调控分子。大量研究表明miRNA参与调节生物体内分子过程以及各种疾病的发生过程，但针对m6A甲基化修饰是否会对miRNA调节疾病相关过程产生影响的研究却微乎其微。为了解答这一问题，云序客户通过高通量测序以及多种分子机制研究手段对m6A影响miRNA分子机制的研究进行了揭示，并且在oncogene上发表了相应的研究成果（Deoxycholic
acid modulates the progression of gallbladder cancer through
N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation），本文结合本文结合meRIP, miRNA-seq,qPCR等多种技术，揭示了脱氧胆酸可能在胆囊癌中发挥作用，为胆囊癌提供了一种新的诊治策略。
发表期刊：Oncogene
影响因子：7.971
实验方法: miRNA-seq ，m6A-meRIP-qPCR，双荧光素酶实验
文章链接：Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation
研究内容
(1) 人GBC标本中血清DCA水平分析
越来越多的证据表明，BA稳态的失衡是疾病的主要特征，因此作者对正常人和GBC患者的血清进行BAs检测，结果发现，与正常个体不同，GBC患者中大多数血清BA水平明显升高(图1a)，这表明BAs稳态被明显破坏，并可能影响疾病的发生和进展。与之相反，DCA（一种继发性游离性BA）被发现在GBC患者中明显降低。此外，与GBC相比，胆囊腺瘤(GA)是一种侵袭性较弱的胆囊疾病，其血清中DCA水平较高(图1b)，表明DCA下调水平依赖于癌症表型。这些发现显示DCA可能是一种新的GBC诊断生物标志物。
为了探讨使用血清DCA作为GBC患者诊断生物标志物的可能性，作者评估了受试者工作特征(ROC)曲线。作者发现血清DCA水平的ROC曲线下面积为0.87，高于CA19-9（常规诊断生物标志物）的ROC曲线0.71。此外，血清DCA水平越低，GBC越具有侵袭性，表现为肿瘤块更大且Ki-67表达更强(图1d,
e)。因此，血清DCA水平可能是GBC的潜在诊断生物标志物。
并且，DCA水平下降的GBC患者总体生存率较差。此外，单因素回归分析显示，GBC患者的肝脏侵袭性、肿瘤大小、TNM分期、远程转移、淋巴结转移、T分类和血清DCA水平均与生存期密切相关(图1g)。多因素回归分析显示DCA可作为GBC患者预后诊断分子标志物。综上研究结果显示，DCA在GBC患者中表达下调，且与不良临床结果相关，可将DCA确定为GBC的潜在生物标志物。
(2) DCA在GBC细胞中具有抑瘤作用
近期研究表明，BAs在某些肿瘤中积累可减缓肿瘤增殖说明BAs可能具有抑癌作用。由于胆囊BAs与血清BAs密切相关，作者测定了DCA在胆囊的浓度范围。然后，作者测定了三种人GBC细胞株中DCA浓度范围在nM到
μM范围内的细胞存活率，发现三种GBC细胞的细胞活力在μM范围内均受到影响。为确定DCA是否对GBC发展产生影响，作者在体外通过不同浓度的DCA对NOZ和GBC-
SD两种人GBC细胞系的生物学行为进行了评估。DCA处理明显降低GBC细胞活力，且呈剂量依赖性(图2a)。接下来，作者研究了DCA是否影响GBC细胞的增殖。增殖实验结果显示，DCA处理明显减少NOZ和GBC-
SD细胞的增殖(图2b)，说明DCA可能减缓GBC肿瘤细胞的生长。集落形成试验表明，DCA处理后，NOZ和GBC-SD细胞的集落数量明显减少(图2c)。作者进一步研究了DCA对裸鼠GBC移植瘤生长的影响。通过皮下注射GBC癌细胞给小鼠，然后喂食含有0.1%
DCA的饮食或等量的载体。与对照组(vehicle)相比，DCA治疗组肿瘤生长速率(图2d,
e)和肿瘤重量(图2f)均明显降低。此外，Ki-67免疫染色对来自不同小鼠的肿瘤的组织病理学分析显示，DCA治疗组的增殖率低于对照组(图2
g)。综上所述，体内外实验结果表明，DCA对GBC具有抑瘤作用。
(3) DCA降低GBC细胞中miR-92b-3p的表达
作为一种非编码RNA，miRNAs已经成为癌症的关键调控分子。作者进行了高通量miRNA-seq检测，发现DCA处理的NOZ细胞中有26个miRNA的表达与vehicle处理的相比存在明显差异。分析结果显示，在DCA处理后，17个miRNA下调，更小的miRNA被上调(图3a)。对上述处理的NOZ和GBC-SD细胞进行PCR
(qPCR)分析显示在下调的miRNA中，下调较明显的是miR-92-3p
。此外，GBC细胞中miR-92b-3p的表达也受DCA剂量依赖性的减少(图3c)。为了进一步探究miR-92b-3p在GBC细胞中的作用，作者建立了稳定过表达miR-92b-3p的NOZ和GBC-
SD细胞系，发现miR-92b-3p明显增强了细胞的增殖。miR-92b-3p的异位表达部分减弱了DCA介导的肿瘤生长减缓。此外，作者也分析了miR-92b-3p在手术切除旁组织和GBC组织标本中的表达水平，发现miR-92b-3p在组织中的表达高于旁组织。这些结果显示miR-92b-3p可能参与了疾病进展的不同阶段，并可能导致较差的临床结果。
为了验证该项假设，作者通过数据库研究miR-92b-3p的表达是否与GBC的预后密切相关。然而，在TCGA中没有发现miRNA表达与GBC存活时间的关系，可能是由于样本量小。但作者也发现，miR-92b-3p的高表达与较短的生存时间明显相关。因此，作者测量了miR-92b-3p在GBC组织样本中的表达，结果显示过表达miR-92b-3p的GBC患者总生存时间较低表达miR-92b-3p的患者短。这些数据表明，miR-92b-3p是GBC的一种新的致癌因子，DCA可能通过控制GBC细胞中miR-92b-3p的表达而发挥减少因子的作用。
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