Nature子刊m6A修饰携手miRNA揭示脱氧胆酸在胆囊癌中作...-2
(4) MiR-92b-3p作用于PTEN降低PI3K/AKT信号
为了探究潜在的miR-92b-3p靶基因，维恩图结果显示磷酸酶和紧张素同源基因(PTEN)可能是潜在的候选基因。为了进一步验证，作者使用含有miR-92b-3p 的PTEN 3’-UTR片段的载体进行了双荧光素酶实验。与对照组相比，miR-92b-3p对含有PTEN
3’-UTR的载体的荧光素酶活性表现出剂量依赖性减少NOZ和GBC-SD细胞。然而，在含有突变PTEN 3’-UTR的载体中，miR
-92b-3p结合位点发生突变，荧光素酶报告基因的活性未受影响。此外，在NOZ和GBC-SD细胞中，过表达miR-92b-3p会降低PTEN
mRNA水平，而敲除miR-92b-3p则会提高PTEN
mRNA水平。作者使用AGO2的抗体进行了RNA免疫沉淀(RIP)，然后进行qRT-PCR，发现miR-92b-3p和过表达miR-92b-3p的NOZ细胞和GBC-SD细胞的miRNA-RISC复合物中，PTEN
mRNA富集。综上所述，这些结果表明PTEN是miR-92b-3p靶向基因。
为了进一步确定miR-92b-3p在GBC细胞中的生物学作用，作者使用NOZ细胞敲低了miR-92b-3p进行了整体RNA表达分析。PI3K/AKT通路在基因集富集分析图中富集。接下来，通过免疫印迹法测定miR-92b-3p对PI3K/AKT信号通路的影响。敲低miR-92b-3p后p-AKT
(Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1(phospho
T37)的蛋白水平明显降低，而在NOZ和GBC-SD细胞中过表达miR-92b-3p则明显升高。这些数据表明，miR-92b-3p通过减少PTEN的表达，作为PI3K/AKT信号的上游因子。此外，DCA处理GBC细胞后下调了miR-92b-3p的表达，PTEN
mRNA和蛋白水平明显升高。与上述研究结果一致，DCA处理明显降低了NOZ和GBC-SD细胞的PI3K/AKT信号通路。综上所述，这些结果表明，在胆囊癌中，miR-92b-3p下调可通过上调PTEN来减少致癌PI3K/AKT信号。
(5) 特定位点的m6A修饰与pri-miR-92b的DCA转录降低相关
有报道称甲基化会影响miRNA成熟，因此研究DCA处理是否会改变pri-miR-92b的甲基化水平也十分关键。首先，作者通过对pri-miR-92b序列进行分析，发现了一个m6A位点。随后通过使用meRIP-qPCR研究了DCA处理是否介导了GBC细胞中pri-miR-92b的m6A水平。后续qRT-PCR结果显示在处理后的细胞中，pri-miR-92b的m6A水平明显降低。此外，下调METTL3消除了DCA处理介导的pri-miR-92b
m6A甲基化的改变，揭示了DCA介导的pri-miR-92b的甲基化主要依赖于METTL3。接下来，作者评估了pri-miR-92b、pre-miR-92b和miR-92b-3p在NOZ和GBC-SD细胞中表达水平。发现，DCA处理的细胞中pri-miR-92b的水平明显高于对照组细胞；相反，DCA处理后，pre-mir-92b和miR-92b-3p水平降低。为了验证甲基化调节miR-92b-3p的成熟，作者进行了体外RNA处理实验。在体外，pri-miR-92b与过表达miRNA加工酶DROSHA和DGCR8的HEK293T细胞共孵育。与未甲基化的对应物相比甲基化修饰的pri-miR-92b转化为pre-miR-92b和miR-92b-3p的效率更高。符合pri-miR-92b的成熟与甲基化相关的推测，当pri-miR-92b中的METTL3-催化基序突变时，pri-miR-92b向成熟形态的转化速度明显降低。因为miR-92b-3p影响GBC细胞系的增殖，pri-miR-92b的甲基化可能与GBC的进展密切相关。接下来，meRIP-qPCR检测在GBC组织和邻近正常组织样本中pri-miR-92b的甲基化水平。结果显示，GBC组织中pri-miR-92b的甲基化程度明显高于邻近的正常组织标本。综上所述，这些体外和体内结果证明了DCA通过引起在GBC细胞中的甲基化位点特异性m6A的减少而减缓miR-92b-3p的成熟。
(6) DCA通过与METTL3结合来破坏METTL3 -METTL14- WTAP复合物
然后作者研究了DCA调节pri-miR-92b的m6A修饰分子机制。越来越多的证据表明METTL3-METTL14-WTAP复合物在在哺乳动物核RNA的m6A沉积中起着关键作用，因此作者研究了DCA对这三个基因表达的影响。然而，包括METTL3在内的这些基因的mRNA和蛋白质水平没有变化，DCA处理GBC细胞时，观察到METTL14和WTAP，说明DCA可能是通过破坏METTL3-METTL14-WTAP复合物发挥作用。作者认为DCA可以直接绑定到一个组件上从而干扰复合物的形成。为了证实这一点，作者进行了两种生化分析。通过药物亲和反应靶稳定性(DARTS)检测，发现METTL3蛋白与DCA在体外直接结合，在NOZ和GBC-SD细胞中均以剂量依赖的方式通过蛋白酶减少其降解。为了进一步验证这一假设，作者进行了免疫共沉淀实验。如预期的那样，在没有DCA处理下METTL3与METTL14和WTAP形成络合物；相反，DCA处理后观察到METTL3与METTL14和WTAP不能形成复合物。这些结果支持了DCA通过与METTL3结合破坏METTL3-METTL14-WTAP复合物从而导致pri-mir-92
b甲基化水平下降从而影响miR-92b-3p成熟。
(7) DCA通过下调miR-92b-3p表达减缓GBC生长
为了进一步探究miR-92b-3p在GBC中的关键作用，作者在裸鼠皮下接种了体外表达的miR-92b-3p或空载的NOZ细胞，然后给裸鼠喂食含有DCA的食物或等量的载体。与空载体相比，过表达miR-92b-3p提高了细胞的增殖能力，而DCA处理可以提高细胞的增殖能力明显减弱miR-92b-3p介导的肿瘤生长。同样，免疫组化法测定Ki-67、p-AKT
(Ser473)、p-70S6K (Thr389)和peIF4EBP1 (phospho
T37)发现在DCA处理后增殖率明显降低，AKT信号通路水平明显降低；在GBC中，miR-92b-3p过表达通过靶向PTEN部分挽救了DCA诱导的生长减缓。接下来，作者评估了血清DCA水平与GBC组织标本中miR-92b-3p水平的相关性。结果显示，血清DCA水平与GBC组织标本中miR-92b-3p水平呈负相关。考虑到miR-92b-3p靶向PTEN降低AKT信号通路，作者测量了GBC组织样本中PTEN、p-AKT
(Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1 (phospho
T37)蛋白水平。发现除PTEN外，其余蛋白均与GBC中DCA水平呈负相关，而GBC中DCA水平较低。综上所述，这些结果表明，在GBC组织中存在DCA-miR-92b-3p-PTEN-PI3K/AKT调控轴，这可能为GBC提供了一种新的诊治策略。
