免疫磁珠联合拉曼探针实现埃博拉病毒的POCT检测
出血热疫情爆发，例如埃博拉病毒，由于缺乏低成本和易操作的检测方法以及初始临床症状类似其他疾病（如拉沙热），导至其难于检测和控制。目前的分子诊断方法如PCR检测，需要专业的人员与实验设施，因此妨碍了疫情现场的及时检测。尽管侧向流免疫层仪等快速检测方法已经被广泛开展，但是不能很好地区分具有类似症状的多种疾病。早期检测与控制埃博拉病毒爆发需要简单和易于操作的方法，以便于从其它更常见的拉沙热疾病中区分出埃博拉病毒感染。在这个研究中，研究者们发展了一种简单的免疫检测方法，他们利用磁珠联合拉曼探针来同时地检测同一份血液样本中埃博拉病毒、拉沙热病毒和疟疾的不同抗原，并且30分钟内即可以完成单个或批处理样品的检测（检测原理见图1）。利用2014年西非埃博拉疫情爆发采集的190份临床样本，163份疟疾阳性对照和233份阴性对照，实验结果展示了埃博拉检测具有90.0%敏感性和97.9%特异性，而疟疾检测具有100.0%敏感性和99.6%特异性。这些结果以及相应的活病毒和对非人灵长类动物埃博拉病毒、拉沙热病毒和疟疾的检测，指出SERS技术作为重要工具将对资源贫乏环境下疫情检测和临床分类具有重大潜力。
图1. 采用磁珠联合拉曼探针检测埃博拉病毒、拉沙热病毒、疟疾的原理示意图。A. 拉曼探针技术原理：拉曼探针采用60nm金纳米颗粒作为信号增强介质，表面吸附不同的拉曼信号分子做为检测不同病毒的指纹；外壳为20-30nm的氧化硅包覆层，就可以阻止拉曼分子泄露，又可以防止检测体系中干扰物的影响；外表面修饰针对不同病毒抗原的特异性抗体。B. 具有不同拉曼信号分子的纳米探针的Raman指纹谱图。C. 病毒抗原捕获与标记检测示意图：微米磁珠修饰抗体首先捕获病毒抗原，拉曼探针标记形成夹心复合物，磁分离富集后进行拉曼检测，该方法可实现均一的免洗检测。
笔者分析，这种检测方法的核心技术包括三方面：（1）快速磁分离与单分散低非特异性的高性能磁珠，确保检测速度、一致性和抗干扰。（2）灵敏、均一的特异性拉曼探针：60nm纳米金的选择作为表面拉曼散射增强介质是个优化选择，这也被著名材料科学家聂书明教授应用于体内拉曼成像研究，尺寸均一性是非常重要的，以确保均一的增强；核壳结构的设计确保拉曼信号分子免于干扰，也防止了聚集导至的热点信号增强效应，这对建立在复杂体系检测的一致性是非常重要的；选择不同的拉曼信号分子可实现多元检测；注意，磁珠分离技术的应用帮助实现了免洗多元拉曼检测。（3）灵敏的便携式拉曼检测设备。笔者充满期待，也希望更多的研究者和公司致力于发展磁分离联合拉曼增强检测的新技术，以便更好地服务临床诊断，尤其是急性、爆发性传染疾病的快速现场即时检测。
图2. 血液中单组分滴定曲线和包容性测定。(A) 疟疾(P. falciparum)HRP2重组抗原滴定曲线，(B)活埃博拉Kikwit病毒滴定曲线，(C) 活拉沙热Josiah病毒滴定曲线。(D) 疟疾HRP2包容性检测，采用疟疾阴性全血样本、P. vivax血清样本和P. falciparum全血样本，(E) 埃博拉病毒包容性检测，采用各种高浓度埃博拉病毒样本，(F) 拉沙热包容性检测，采用各种高浓度拉沙热病毒样本。数据来自三个实验重复的平均值，SD表示误差棒。
图3. 各种抗原加入的检测。来自埃博拉、拉沙热和疟疾检测的信号分别以蓝色、橙色和灰色显示。加入的抗原分别为ZIKV（MR766），ZIKV（PRVABC59）或DENV2（1×106 PFU/ml），或加入重组拉沙热NP、埃博拉（EBOV VP40）、恶性疟原虫HRP2抗原的血液样本。数据来自三个实验重复的平均值，SD表示误差棒。
图4.埃博拉病毒（EBOV：Ebola virus）感染非人灵长类动物（NHPs：nonhuman primates）血液样品的检测结果。(A) 感染埃博拉病毒的两个不同NHPs的血液中埃博拉信号的时间进程，每个点代表三次实验的平均值。(B) NHP血液的三元检测。1例为未感染对照组（Neg）， 9例为埃博拉晚期感染NHP（1 ~ 9例）。
图5. 埃博拉和疟疾病毒的临床试验结果。(A) 埃博拉阳性（Pos）和阴性（Neg）样本检测结果。(B) 疟疾阳性和阴性样本的检测结果。 (C和D) 埃博拉和疟疾对应的ROC曲线。 AUC：ROC曲线下面积，CI：95%置信区间。
原文出处：Sebba et al., A point-of-care diagnostic for differentiating Ebola from endemic febrile diseases, Sci. Transl. Med. 10, eaat0944 (2018)
