骨髓基质来源的间充质干/祖细胞（MSCs)的培养基本原则
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 骨髓基质 |
| 试剂、试剂盒 | 完全培养基（CCM） 无钙或镁的磷酸盐缓冲液 无钙或镁的Hank’s平衡盐溶液 Ficoll-Paque淋巴细胞分离液 |
| 仪器、耗材 | 聚丙烯离心管 15 mL和50 mL 塑料组织培养皿 直径15 cm 塑料微量移液器枪头 10μL |
| 实验步骤 | (a)去除抗凝管盖子，将骨髓液转移至50mL离心管中。加人室温的HBSS,确保体积达到25 mL。 (b)取另一个50 mL离心管，加人20 mL Ficoll-Paque淋巴细胞分离液，将25 mL细胞悬液轻轻加到Ficoll上层。HBSS与Ficoll间的界面不能被破坏。 (c)关闭闸，室温1800g离心30min。 (d)离心完毕，于Ficoll和HBSS的界面收集白色细胞层,将其移至新的50 mL离心管中。 (e)用HBSS将收集到的细胞悬液体积调至3倍，室温1000g离心10 min。重复洗涤。 (f)用30 mL预热至37℃的CCM重悬细胞 (g)取10μL细胞悬液加入到10μL台盼蓝中，血细胞计数器评价细胞的存活率，存活率需高于80%。 (h)将30mL细胞悬液移至直径15 cm组织培养皿中，于5% C02培养箱中培养至少15h。 (i)从培养箱中取出培养皿，吸出培养基。 (j)加入20 mL预热的PBSA,润洗单层细胞，弃去。 (k)重复润洗过程3次。 (l)加人30 mL预热的新鲜CCM。 (m)每隔一天重复此润洗和更换培养基操作，共6天。 (n)6天后，在倒置显微镜下观察单层细胞，贴壁的、成纤维细胞样MSCs克隆在培养皿中清晰可见。有时可能有造血细胞污染的迹象，但这些细胞可以在传代时被去除。培养物达到50%〜60%汇合时，进行扩增和冻存处理。 展开 |
| 注意事项 | |
| 其他 | 培养基配方: 完全培养基（CCM)：α-MEM: α低限量基础培养基 含谷氨酰胺 无核苛酸或脱氧核苷酸；添加：附加L-谷氨酰胺2 mmol/L(终浓度 包含组分内的谷氨酰胺共4 mmol/L)，20%经FBS杂交瘤纯化 非热灭活，青霉素100 U/mL，链霉素100μg/mL。过滤除菌 储存于4℃ 不超过2周。 |
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