NBT | 小分子配合CRISPR系统实现靶基因的剂量依赖性激活
目前以CRISPR-Cas9为基础的基因编辑及基因调控技术已取得众多成果，除最基本的靶位点DNA切割/修复外，通过将Cas9与不同的因子组合，还可实现靶位点的碱基编辑、表观基因组编辑以及基因表达的激活/抑制。其中表观基因组编辑和基因表达的激活/抑制是通过将失活型Cas9（dCas9）与转录调控因子融合而得，通过gRNA的定位，便可实现表观遗传修饰及后续靶基因表达的精准调控【1-5】。现有的以CRISPR-Cas9为基础的转录调控系统依赖于外源的转录调控因子，且很难实现剂量依赖的转录调控，因此依然有很大的进步空间。
2019年11月11日，来自北卡罗来纳大学教堂山分校药学院的Nathaniel A. Hathaway实验室与西奈山伊坎医学院的Jian Jin实验室合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Dose-dependent activation of gene expression is achieved using CRISPR and small molecules that recruit endogenous chromatin machinery 的论文。文章在dCas9系统的基础上，通过开发名为化学表观遗传修饰因子（CEM）的小分子，可实现内源性转录调控因子的定向富集，从而实现靶基因的激活。文章证实dCas9-CEM系统对基因表达的激活调控呈现出剂量效应，且调控可逆并高度特异。该系统对基因功能和疾病治疗研究，特别是表型与基因剂量的相关性研究有重要意义。
本文的关键是化学表观遗传修饰因子（CEM）的小分子，这是一类双功能配体，拥有两大功能域，其一是FK506，这是FKBP蛋白的配体，可以结合dCas9-FKBP融合蛋白，由此可以借助dCas9-sgRNA实现靶位点的精准定位；其二则是各类转录调控因子的配体，本文中用到的三种配体分别是CEM87、CEM88和CEM114，分别可以结合BRD4、BRPF1和CBP/p300这三类转录激活因子（图1）。dCas9-CEM系统工作的基本原理是，dCas9-sgRNA负责定位，CEM发挥桥梁的功能，一端结合dCas9-FKBP，一端则募集内源的转录调控因子，实现因子的定向富集，最终激活靶基因。
图1 dCas9-CEM系统简介
作者首先构建了外源性的GFP报告系统，在293T细胞中对dCas9-CEM系统激活基因的能力进行了验证，结果证实该系统能有效的激活外源性GFP的表达。为进一步优化基因调控的效果，研究者尝试采用MS2和SunTag系统，将dCas9-FKBP融合蛋白拆分，借此或可增加靶位点处的CEM水平（图2），结果发现dCas9-MS2-FKBP×2-CEM系统效果最佳，后续的研究便由此开展。
图2 dCas9-MS2-FKBP-CEM系统
随后研究者对CEM激活基因表达的特点进行了分析，发现用CEM87和CEM114处理24小时后便能明显激活基因表达，而且在浓度为6.25~200 nM的范围内，这种激活调控呈现出剂量效应。研究还指出，CEM对靶基因的激活调控是可逆的，这有助于基因表达的瞬时调控。
之后研究者选取多种内源基因如MYOD1、IL1RN和BRD4等基因，检测dCas9-CEM系统的有效性，结果发现无论针对MYOD1和IL1RN的启动子区域或是针对BRD4的超级增强子区域，dCas9-CEM系统均能有效激活其表达；以CXCR4为靶点的研究还证实，dCas9-CEM系统能在RNA水平和蛋白水平促进靶基因的表达。文章的最后，研究者还通过转录组分析和ChIP-seq对dCas9-CEM系统的脱靶风险和特异性进行了检测，发现该系统有着较高的特异性。
总体而言，本研究开发出一系列双功能小分子化合物，再辅以CRISPR-Cas9系统，便可以实现可逆性的靶基因特异性激活调控，而且调控呈现剂量效应。该新系统无需外源性的转录调控因子，这对生物医学研究的安全性和特异性也有很大帮助。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41587-019-0296-7
参考文献
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3. Braun, S.M.G. et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nat Commun 8, 560 (2017).
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5. Hilton, I.B. et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol 33, 510-517 (2015).
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