单克隆抗体技术的方法
1、抗原准备
抗原(Ag)是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质。即能被 T/B 淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合,活化 T/B 细胞,使之增殖分化,产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体),并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此,抗原物质具备两个重要特性:一是诱导免疫应答的能力,也就是免疫原性;二是与免疫应答的产物发生反应,也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原,抗原可依据不同的分类方式分为以下几类:根据抗原性质分为完全抗原和不完全抗原;根据抗原的来源分为异种抗原、同种异型抗原、自身抗原、异嗜性抗原;抗原还可分为内源性抗原、外源性抗原。在进行单克隆抗体制备过程中,很多物质都可以成为抗原,在常规的科研实验中,科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射 10～50μg 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。
2、细胞融合
细胞融合的方法有物理法(如电融合、激光融合)、化学融合法和生物融合法(如仙台病毒),此处列举化学融合法中的一种,即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG),在分子量为200～700时,呈无色、无臭的黏稠状液体;分子量大于1000时,呈乳白色蜡状固体;能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者,常用浓度为50%,pH 8.0～8.2(用10%NaHCO3 调整),分子量小的 PEG,融合效应差,又有毒性;分子量过大,则黏性太大,不易操作。50%浓度,pH 偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50%浓度的 PEG 加上10%二甲亚砜。不同批号的 PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的,一般选供气相色谱用的 PEG。
细胞融合的关键:技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答,这必然是要失败的。融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。
3、杂交瘤细胞
克隆化的细胞可以在体外进行大量培养,收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限,其不能超过特定的细胞浓度,且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠),杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100～1000倍。利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿瘤的生长。
4、动物免疫
单克隆抗体制备的宿主动物一般选用 Balb/c 小鼠,也有一些公司声称开发出了兔的单克隆抗体制备技术,目前暂无具体的优劣比较结果,但是鼠单抗的应用范围还是相当广泛的。
免疫原用无菌盐水稀释并与佐剂混合,腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液,在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫。
5、克隆化方法
经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般来说越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长,互相争夺营养和空间,而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早,太早细胞性状不稳定,数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞,经过一段时期培养之后,也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失,使部分细胞丧失产生抗体的能力,所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱决定。一般来说,免疫性强的抗原克隆次数可少一些,但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多,包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
