农杆菌介导水稻转化
实验概要
本实验介绍了农杆菌介导的水稻转化。
主要试剂
GUS染色液：100 mmol/L NaPO4 (pH7.0)；0.1% Triton X-100；10 mmol/L EDTA；0.5 mmol/L亚铁氰化钾
头抱霉素，乙醇，次氯酸钠溶液
主要设备
高速离心机，培养箱，人工气候室
实验材料
水稻种子
实验步骤
1. 幼胚愈伤组织的诱导
取开花后12-15天的种子，70%乙醇消毒1分钟，无菌水冲洗2-3遍；再用2%有效氯的次氯酸钠溶液振荡消毒60分钟以上，无菌水冲洗4-5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接在N6D2培养基上，于28℃暗培养4天。
2. 根癌农杆菌的培养
从YEB固体培养基上挑取根癌农杆菌单克隆接种到20ml含Km 50mg /l的YEB液体培养基中28℃摇菌培养至对数生长晚期；再从中取0.5mI转接至50mI同样的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600为0.5左右。
3. 共培养及转化、筛选、分化
1) 将培养好的根癌农杆菌4000g离心10分钟后，沉淀用等体积的AAM-AS培养基重悬；
2) 将预培养4d的来源于中花11号幼胚的愈伤组织侵入此AAM-AS菌液中侵染20min，用无菌滤纸吸干后转移到N6D2C培养基上(在培养基表面铺一张无菌滤纸)，25℃，暗培养3d；
3) 将愈伤组织用含300mg/L头抱霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代；
4) 两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代((2周/代)；
5) 取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃)中培养7d；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗；
6) 再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；
7) 待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培。
4. 水稻组织培养和转化过程中使用的培养基及其成分
5. 转化植株的组织化学分析
将经根癌农杆菌转化后产生的抗性愈伤组织及转化植株的叶片和根段分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，观察蓝色反应。染色后的组织用70%乙醇脱色。
