植物基因转化常用方法-4
1.2 其它的基因附加工程
在水稻、棉花、马铃薯、番茄和其它作物上也进行了δ-内毒素工程，获得昆虫抗性也不仅仅是指有着一种方法。蛋白酶抑制剂也是较好的选择，它可以一只昆虫肠道内的蛋白酶活性，阻止或减缓害虫生长，许多植物能产生蛋白酶抑制剂，如豇豆和common bean, 他们的基因已经被成功的转移到其他植物中，但一般蛋白的表达量比较低。这种抑制剂对甲虫的效果非常明显，所以对需要长期贮存的种子作物是一种很好的选择。
2、基因扣除
基因扣除这一词语不是很恰当，因为并不去除基因，只是让基因失活。有许多方法可以使基因失活，最成功的是反义技术。我们将以延长货架期的工程番茄为例进行说明。
2.1 反义技术的原理
在一个反义实验中，克隆的基因是反向的连接到载体中，这意味着当克隆的基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，有时缩写为asRNA。
一个反义RNA阻止原有基因合成表达产物，我们尚不清楚其潜在的机理是什么，但可以肯定，正义和反义RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。
2.2 利用反义RNA延迟番茄果实的成熟
美国的Calgene公司和英国的ICI种子公司利用反义技术改造番茄，延长其货架期。
a)多聚半乳糖醛酸酶在番茄果实成熟过程中的作用
番茄从开花到收获需要大约8周的时间，第6周开始，果实的颜色和风味开始变化，此时成熟过程的基因开始启动，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果实开始软化。运输过程中，造成伤害，降低了商品品质。
b)克隆多聚半乳糖醛酸酶基因
在1980s中期，ICI种子公司的生物技术部与Nottinghan大学合作进行了实验。从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端获得了一个730bp的限制性片断，包含了一半的编码序列，将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。引入植物后，转录后形成了反义RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。
图11-29 延迟成熟番茄的构建过程
pBIN19分子重组到根癌农杆菌中，用来侵染番茄茎断，转移到含kan的培养基中，再生形成了完整的植株。
实验的结果通过4个途径分析：
1、Southern杂交检测反义基因
2、Northern杂交检测反义基因的转录，利用只能与反义RNA杂交的单链探针。
3 反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响，通过与正义RNA的Northern杂交检测，使用与正义mRNA特异的探针。史研究显示，转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照。
4 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。
转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但可以存放很长的时间。这意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。
图11-30 转基因番茄PG酶活性的变化
三 病毒介导的遗传转化
植物病毒广泛存在，而且不受单子叶或双子叶的限制。因此病毒作为植物基因工程的载体日益受到人们的重视。在已知300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。RNA不适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。在植物上已知有两种DNA病毒，花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）和双联体病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想载体。
花椰菜花叶病毒载体已用来克隆了一个基因进入芜箐甘蓝，有两个因素限制了其应用：
1） 花椰菜花叶病毒基因组的大小，即使是切除了非必须序列，花椰菜花叶病毒载体的承载插入片段的能力还是有限的，只能插入很小的片段。
2） 花椰菜花叶病毒的寄主范围非常窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。
二价病毒可能比较有潜力，侵染重要的作物，如玉米和小麦，然而在侵染过程中，二价病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。这种病毒可引起破坏性的侵染，需要严格的防护，防止载体从寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花叶病毒和二价病毒作为克隆载体还需要进一步的改造。
四 基因枪转化法
农杆菌侵染双子叶植物获得转基因植株是非常成功的，自然界中的农杆菌只侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。虽然通过添加乙酰丁香酮类物质可使农杆菌侵染单子叶植物，但单子叶植物的再生比较困难，因而农杆菌转化单子叶植物仍然是比较困难的。1984年，科学家发现，超螺旋结构的细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。受这一现象的启发产生基因直接转移技术。重组机制并不清楚。因为细菌质粒与植物DNA之间没有同源性。事实上整合是随机的发生在植物染色体的任何位点。
图11-31 植物基因直接转移的原理
基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下：
DNA微弹的制备
DNA-微弹载体的制备
靶外植体准备
DNA微弹轰击
轰击后外植体的培养
基因枪转化率差异很大，一般在10-3~10-2之间。McCabe在大豆上高达2%，而有的报道仅有10-4。相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高；嵌合体比率大
遗传稳定性差。即使这样，该方法在单子叶植物上也有广泛应用，有如下优点：
a) 无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。
b) 受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。
c) 可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞。
d) 操作简便迅速。
正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）。
e) 植物基因表达调控研究。
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