不同垫料对SPF级KM小鼠学习记忆能力影响的分析研究
摘要:
目的
探讨非专业加工制作的麦秸垫料、玉米芯垫料、刨花垫料和纸质垫料对SPF级昆明小鼠(KM)学习记忆能力的影响差异,以及不同垫料对小鼠行为学的影响。方法选用SPF级KM小鼠24只,分别使用麦秸垫料、刨花、玉米芯和纸质垫料饲养8周后,开展 MORRIS水迷宫行为学实验,考察其行为学的变化和学习记忆能力的差异。
结果
麦秸组学习记忆能力增加明显高于刨花组(P<0.05);水迷宫实验期间,各组增重差异不显著。定位航行实验结果显示,麦秸组第5d的逃避潜伏期显著低于其余三组(P<0.05),其余时间段差异无显著性;空间探索实验结果显示麦秸组小鼠穿过原平台位置的次数、游泳时间均多于其余三组。
结论
不同垫料对水迷宫实验中KM小鼠的体质量影响较小,麦秸垫料对KM小鼠学习记忆能力的影响优于刨花垫料和玉米芯垫料,建议将麦秸垫料作为实验动物接触性垫料推广使用。
垫料是实验动物生存环境中的接触性基础材料,不同的垫料生存环境直接影响实验动物的生理活动,进而影响动物实验结果的准确性,选择不同垫料也是体现动物福利的重要内涵。因此,实验动物国家及地方标准对实验动物垫料的物理性状、化学及生物特性都有明确的规定和要求。目前所知实验动物品种、品系、年龄、性别等对实验动物记忆能力均有不同程度的影响,但未知不同垫料饲养环境对实验动物记忆认知能力是否有影响。为了进一步探索新型麦秸垫料的安全性及其对啮齿类实验动物接触环境的影响,本实验采用SPF级昆明小鼠为研究对象,应用 MORRIS水迷宫行为学实验方法,比较、开发利用新型麦秸垫料和其他3种垫料(刨花垫料、玉米芯垫料和纸质垫料)在工作状态下对小鼠学习记忆能力和血液生化指标的影响。为今后开展与改善学习记忆能力相关药物研究的实验动物垫料选择提供参考,也为新型麦秸垫料的安全使用和大力推广提供依据。
1.1实验动物
SPF级KM小鼠(孕13d)8只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016 0006],饲养在北京实验动物研究中心屏障内,小鼠自由进食、进水，温度:18~26℃,湿度:38%~50%。维持12/12h暗交替光照。所有实验操作遵循动物使用相要求,福利伦理审查批准号: BLARC2017112401。
1.2垫料及主要仪器
1.2.Ⅰ新型麦秸垫料:利用蒸汽爆破工艺对麦秸原料进行爆破,做进一步处理后,进行Co照射及真空包装后获得新型麦秸垫料。玉米芯垫料、刨花料均购自北京科澳协力饲料有限公司;纸质垫料购自北京美绿洲生物科技有限公司。
1.2.2主要仪器:超净工作台(苏杭);电子天平 (Sartorius,BSA220ZS型):水迷宫(ZS40 ZS001 MORRIS水迷宫动物行为分析系统(众实迪创购自北京美绿洲生物科技有限公司)。
1.3方法
1.3.1实验分组:8只KM孕鼠单笼饲养,2只/笼分别饲养在麦秸垫料、玉米芯、刨花和纸质4种垫料中。选取离乳后仔鼠24只,随机分为4组,每组6只,雌雄各半,分别按照使用垫料的不同分为麦秸垫料组、玉米芯组、刨花组和纸质垫料组。每周更换次垫料,常规饲养。在相同环境条件下继续饲养8周后,观察各组小鼠的相应指标。
1.3.2适应性观察:观测KM小鼠分别对4种垫料饲养适应情况,观察小鼠行为反应、身体清洁度、有无外伤及过敏、嚼食垫料等情况。
1.3.3水迷宫行为学测试:应用ZS-01 MORRIS水迷宫实验装置,开展隐藏平台实验和空间探索实验,检测小鼠在水迷宫装置中的学习和记忆能力。
1.3.3.1定位航行实验:连续6d分别对麦秸、刨花、玉米芯及纸质垫料饲养的4组小鼠进行入水训练和测试,每天训练4次,确保4个象限每天只用1次。第一天为适应性训练,将小鼠放入不含平台的水池中自由游泳120s,每次训练完成后,迅速用干净的干毛巾将小鼠擦拭干净后放回笼盒,并保证其饮水和食物供应,便于小鼠提前适应环境,减少应激反应。其余5d为正式试验,每天固定时间训练4次,每次训练间隔15~20min。训练时间设置为90s,90s内小鼠未找到站台,则由实验人员将其引导至站台,并在站台上停留10s,逃避潜伏期记为90s。将逃避潜伏期均值作为参数进行数据统计。
1.3.3.2空间探索实验:实验时间为1d,去除平台中心支架,任选一个象限入水点将KM小鼠放入水中,测试60s小鼠在恒温池中的游泳时间以及目标(原平台位置)的次数。
1.3.4体质量的检测:实验期间,每天实验前对所有小鼠进行称重并记录
1.4统计方法
采用SPSS22.0软件进行统计学分析,实验数据均用平均数±标准差(±s)表示,各组间逃避潜伏期和体质量的比较采用ISD方差分析;各组间穿越站台次数采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1动物适应性研究
通过实验观察,麦秸垫料对小鼠无刺激作用,小鼠行为、反应正常。同其他3种垫料相比,换垫料1周后,麦秸垫料相对干燥度良好;相比玉米芯垫料没有尿液集中渗漏的情况;相比纸质垫料,没有排泄物裸置的情况。
2.2定位航行实验
逃避潜伏期结果如表1所示。在5d的定位航行实验中,各组小鼠的潜伏期均随着训练天数的增加而缩短,由此可知,在4种垫料饲养环境下的KM小鼠经过训练后均可获得一定的空间学习能力。由图1可见,自第2天起,麦秸组、玉米芯组和纸质组的潜伏期呈下降趋势,其中麦秸组较其他3种垫料组具有明显的优势。进一步对组内各时间点的潜伏期进行两两比较,结果显示,第5天的潜伏期麦秸组显著低于其他3组(P<0.05),其余各组间两两比较差异不显著,由此可见经麦秸垫料饲养下的KM小鼠在空间学习能力可得到明显的提高。
2.3空间探索实验
实验结果如图2所示,各组小鼠穿过目标象限次数、目标象限游泳时间经统计无显著性差异(P>0.05)。但麦秸组的小鼠在穿过目标象限的总次数、游泳时间上均表现出一定的优势,其中穿台次数方面:麦秸组(3、2)最高、刨花组(1、2)、玉米芯组(1、2),纸质组(1);游泳时间方面:麦秸组(17.09s)、刨花组(1122)、玉米芯组(12.21)、15纸质组(16.33s)。这说明在麦秸垫料饲养条件下的KM小鼠可获得良好的空间学习记忆能力,其对空间定位的准确性明显高于其他3组。
2.4垫料对KM小鼠体质量的影响
KM小鼠经四种不同垫料相同饲养环境下饲养8周后,体质量均逐渐增加,结果见表2。其中麦秸组增重最大,刨花组增重最小,两组间变化差异显著(P<0.05);水迷宫测试期间,各组增重两两比较无统计学差异(P>0.05),结果如图3所示。
3讨论
目前,MORS水迷宫实验广泛用于开展海马与脑认知系统的相关研究方面。如 Huang等研究脂多糖对记忆检索的影响,探讨免疫激活与学习记忆功能的相互作用。 Stackman等研究小鼠定向反应与前丘脑神经元之间的关联。范琳犀等研究发现皮质酮慢性注射可诱导C57小鼠抑郁行为发生改变并损害学习记忆功能。刘港等研究结果表明,采用雄性KM小鼠侧脑室注射AB23-35可快速成功制备阿尔茨海默病(AD)小鼠模型。在定位航行实验中,KM小鼠的逃避潜伏期随着训练次数的增加而减少,这与本研究的结果一致。王南溪等用水迷宫实验测试不同剂量的黄粉虫油脂对KM小鼠增重及学习记忆能力的影响。胡华等探讨活血荣络片治疗阿尔茨海默病的机制。在MORRIS水迷宫实验过程中,其测试结果不仅与动物种类有关, MORRIS水迷宫的实验设备、实验环境(光照、噪声)等许多因素均会影响实验结果。周海东等发现平台颜色可以改变大鼠的水迷宫成绩蓝色平台的大鼠学习能力提升速度快于白色平台组。黄明2发现90dB的噪声(2h/天)可以导致KM小鼠空间性学习记忆能力和情绪性记忆能力受损。 众所周知,垫料作为啮齿类实验动物生存环境中的重要组成部分,其原料、形状、大小等因素均会对实验动物及物实验结果有不同程度的影响3。越来越多的研究表明,丰富环境可以对小鼠脑损伤具有复苏的作用,可以改善其记忆和运动能力,认为环境丰富化对啮齿类动物脑功能改善、减轻老龄化带来的空间认知和运动缺陷等具有重要生物学意义。唐莉莉6研究发现丰富环境组的KM小鼠表现活跃,探索主动性增加,丰富环境强化小鼠的情绪学习记忆;而贫瘠环境组小鼠活动减少、情绪烦躁不安,氧化应急水平下降,使机体抵抗外界不良环境的能力下降。吴冰洁等通过对近交系衰老模型SAMP8小鼠的研究也发现并证实了环境丰富能刺激、提高动物体内促肾上腺皮质激素(ACTH和皮质醇(Cor)水平,能减轻精神行为异常及显著提高小鼠的学习及记忆能力。李春禄等通过对野生小家鼠和KM小鼠对丰富环境(锯末垫料为主,普通环境基础上添加玩具)的学习记忆能力影响实验发现早期的丰富环境饲养显著缩短野生小家鼠的潜伏期,KM小鼠没有显著影响,而经过学习训练野生小家鼠和KM小鼠的潜伏期都显著缩短。野生小家鼠更有良好的可塑性和应变能力,而实验KM小鼠经过驯化后对环境变化更容易适应。因此,本实验选用KM小鼠作为研究对象,这与我们的研究结果致。但是,在刨花与玉米芯等常规垫料饲养中,结果显示在4种垫料饲养环境下的KM小鼠经过训练后均可获得一定的空间学习能力,自第2天起,麦秸组、玉米芯组和纸质组的潜伏期呈下降趋势,其中麦秸组较其他3种垫料组具有明显的优势,但差异不显著。
据报道,大小鼠的迷宫实验认知和行为评价的差异也可能和应激反应有关,应激状态下人类和动物释放的肾上腺皮质激素影响记忆的形成,损害记忆的获得和再现。在水迷宫浸水游泳的环境应激下,除了因整体环境因素如垫料富集,增加小鼠的幸福感等对小鼠形成的保护作用,也应该考虑到小鼠个体差异。我们在试验中发现,雌性小鼠的认知能力显著高于雄性,这与宿瑞敏研究结果相一致。本实验发现,新型麦秸垫料可促进KM小鼠体质量增加,且增加情况要优于玉米芯和纸质垫料组,与刨花垫料组相比较差异显著(P<0.05);舒畅等凹曾报道普通刨花垫料对KM小鼠体质量的增加缓慢,本次结果与之相一致。水迷宫实验显示,4种垫料饲养下的小鼠差异不显著,但结合实际饲养环境来看,纸质垫料组的小鼠表现欠佳,不建议完全用纸质垫料饲养或开展相关研究。麦秸垫料组表则明显优于刨花垫料和玉米芯垫料组,因此麦秸垫料可以作为实验动物接触性垫料推广使用。
参考文献
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