Northern blot实验
Northern blot技术
Northern Blot
实验方法原理 |
将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移至尼龙膜等固相膜载体上,用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交,洗膜去除非特异性结合杂交信号,经放射自显影或现色反应,对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较,即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小;对杂交信号的强弱比较,可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。 |
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实验材料 | DNA |
试剂、试剂盒 | MOPS电泳buffer 甲醛凝胶加样buffer EB EGFR探针 DIG SSC |
仪器、耗材 | 水平电泳仪 制冰机 恒温水浴箱 凝胶成像系统 EP管 移液器 Tip头 |
实验步骤 |
一、RNA转移与固定
3. 1xSSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干,夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。
4. RNA染色,干燥的尼龙膜先于5%冰乙酸中室温浸泡15 min。
二、预杂交、杂交及显色
2. 100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。
3. 100 ml antibody buffer(1:5000)孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜(15 minx2)。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中,避光数min至1天(出现颜色时不要摇动)。
8. 照相记录,80℃烤干,储存。
9. 扫描计算EGFR基因扩增的倍数。
展开 |
注意事项 |
1. 避免RNA酶污染,防止RNA降解。
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