基因修饰小鼠（GEM）模型在肿瘤学研究中的应用（三）
5. 确定肿瘤细胞的来源
揭示肿瘤发生过程中的细胞来源将为开发与改善治疗策略提供非常重要的理论基础。应用GEM模型已经成功阐明了某些不同肿瘤类型的细胞起源。在小细胞肺癌（SCLC）研究中，通过气管内注射细胞特异性的Adeno-Cre病毒载体，使Trp53和Rb1两基因分别在Clara细胞, 神经内分泌的（NE）细胞，以及II型肺泡（SPC）细胞被特异性敲除，分析肿瘤发生的不同时间和肿瘤表型等。结果表明，相对于SPC细胞，NE细胞是造成SCLC形成的主要细胞来源。另外，细胞来源的研究也能提供与以前研究结果不一样的意外结果。比如，过去以BRCA1为基础的乳腺癌研究认为，该类癌症的来源细胞是基底上皮干细胞。而在应用GEM模型对BRCA1引起的基底样乳腺癌研究中发现，其实管腔祖细胞才是基底样肿瘤的真正来源。
最近来自两个不同实验的研究结果表明，遗传变异（如Pik3ca突变）可显著地影响干细胞库组成。Pik3ca点突变（如H047R）引起具有谱系特征的乳腺上皮细胞分化为多能干细胞样状态能力损失。而且，Pik3ca乳腺肿瘤的细胞来源主导了其恶性程度，表明了在改善抗癌症药物及治疗效果的特异性方面，准确找到肿瘤细胞来源具有非常重要的实际意义。
6. 验证新药物靶点
考虑到不是所有的癌基因都是维持肿瘤形成所必须的，因此，在针对相应的靶点药物，开展人体临床试验前，即在临床前的动物体内，验证灭活TSG，或者降低致癌基因是否能引起进行中肿瘤的萎缩成为非常重要的试验。应用可诱导小鼠模型可实现对致癌基因维持肿瘤相关性的验证，如在乳腺癌小鼠模型中，癌基因Pik3ca表达去诱导后，引起部分肿瘤的萎缩，提示这些肿瘤是与“依赖”广泛性活性P13K信号密切相关的。然而，多数肿瘤最终因Met或Myc增加而复发，提示这些遗传损伤可能会诱导对P13K抑制剂的耐受性。此例子说明可诱导GEM模型应用于临床前研究，不仅可达到验证药物靶点的目的，而且对揭示药物耐受性的形成机制也具有其实际意义。
TSG也有可能成为有效的药物靶点。由于p53基因的显性负作用或抑制突变，以及其特异性抑制剂MDM2和MDM4的增加/过表达等的原因，导致肿瘤中的p53功能丧失。应用可逆转抑制p53活性的GEM模型遗传学研究表明，重新恢复p53基因功能，可快速使已形成的肿瘤消退，提示研制抑制MDM2分子，从而恢复p53功能，或将突变型p53重新恢复为具有野生型功能p53的抗肿瘤药物的临床意义。同样，应用可诱导敲低APC的GEM模型研究结直肠癌的结果也表明，诱导恢复APC功能后，可迅速引起快速与广泛的肿瘤细胞分化和持续的无复发萎缩，这为体内评价APC/Wnt通路作为APC突变引起的结直肠癌的治疗靶点提供了依据。
7. 阐明治疗效应与耐受
为了将临床试验中抗肿瘤新疗法失败的风险尽量降低到最低，建立临床前高效及预测性强的体内模型，客观评估相应药物效应及耐受性就显得更加重要。通过Kras突变引起的肺癌和胰腺癌的GEM模型的研究发现，GEM模型对靶向治疗和传统化疗的应答效应与相应病人的应答性具有非常大的相似性。需要加以关注的是小鼠与人在药物代谢方面表现明显不同，比如，参与肝脏药物代谢的细胞色素P450酶底物特异性方面，不同的物种存在较大的差异。该类问题可借助人源化小鼠模型加以解决。因此，建立人源化的GEM模型作为临床前药物效果的研究，将有助于优化针对靶特异抗肿瘤药物的研发，以及寻找与确定治疗效应的关键因素，并使其成为肿瘤病人特征的预测性生物标记。另外，GEM模型也可应用于探索治疗敏感性肿瘤获得性耐药的形成机制。
在探讨肿瘤治疗效应与耐受机制方面，K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作为BRCA1突变乳腺癌临床前GEM模型的一个非常有说服力的例子。KB1P小鼠可形成完全模拟类人BRCA1突变乳腺癌组织病理学特征的乳腺肿瘤，而且，对含铂类药物和PARP抑制剂也具有高敏感性。临床试验证实，PARP抑制剂Olaparib可以治疗卵巢肿癌，乳腺癌和结直肠癌。 虽然该药物并不对所有这类癌症病人的治疗都有效果，但其对BRCA1突变携带者表现有明显治疗效果，可能与PARP抑制剂合用引起的协同致死作用与BRCA1缺乏有关。BRCA1突变细胞对PARP抑制剂表现为更加容易被损伤，因为PARP抑制剂诱发的单一链DNA断裂，可导致DNA复制时的双链断裂，造成BRCA1缺失细胞无法实施同源重组机制来修复损伤的DNA。
根据Olaparib在临床试验中获得的理想效果，FDA于2014年12月批准了该药用于BRCA1/2突变卵巢癌病人的治疗。尽管病人对该药物有很好的反应效果，然而，在病人和GEM模型研究中都发现了获得性药物耐受性。通过临床前KB1P小鼠模型研究证实，这类耐药机制与药物运输物及同源重组恢复等数量的增加有关。这些研究结果有助于了解临床上耐药性的产生, 以及设计针对Olaparib耐药病人的改进治疗策略。
关于肿瘤治疗效应与药物耐受性的关系，现在也是越来越清楚，即其影响不仅受肿瘤细胞自身因素，而且与成纤维细胞和免疫细胞等基质因素有关。通过PDAC的GEM模型进行肿瘤干预研究的结果表明，治疗是抑制旁泌性相关信号通路，减少促结缔组织增生肿瘤基质，增加肿瘤脉管系统，导致促进抗肿瘤药物导入肿瘤部位的过程。然而，关于攻击PDAC中的肿瘤基质的概念，最近有两个研究对该理论进行了挑战。这两研究结果表明，基质因素可能通过阻止肿瘤血管形成，引起不是促进而是抑制PDAC生长。所以，这些研究都揭示了肿瘤微环境在治疗耐受性方面，发挥了比过去想象的更加重要的，且复杂的作用。
8. 肿瘤免疫治疗
在过去十年，通过对免疫反应的深刻揭示与认识，建立了利用病人免疫系统攻击肿瘤的治疗策略。近年来的黑色素瘤和肺癌临床病人试验已证实，包括抗CTLA-4和抗PD-1的免疫检查点抑制物，在增强病人有效抗肿瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潜力。这些临床试验基础是来自过去几十年在实验小鼠模型上开展的基础研究，从而揭示了CTLA-4和PD-1在阻止免疫反应中的重要性，特别是通过对CTLA-4和PD-1敲除小鼠出现严重与温和程度的自发性自身免疫表型的明确证实，应用CTLA-4抑制物引起接种肿瘤小鼠的抗肿瘤T细胞反应增加，产生肿瘤排斥作用，提示释放T细胞上的刹车可能是抵抗肿瘤的一个潜力的应对策略。尽管如此，同时也应该清楚的了解，仍有一定比例的病人对此类免疫治疗没有反应，且目前的挑战是还不知道其真正原因。
目前，虽然绝大部分的免疫学研究都是在肿瘤移植小鼠模型的基础上进行的，但就现在研究情况预测表明，今后GEM模型应用于该领域的研究将会越来越多。应用GEM模型研究的部分结果表明，在新形成的肿瘤过程中，因肿瘤引起的耐受机制，T细胞丧失其对肿瘤细胞的反应性，特别明显的是，如果将来自GEM模型小鼠形成的肿瘤细胞，接种至免疫缺陷小鼠体内，肿瘤会快速生长，而野生小鼠则能排斥这些肿瘤细胞。提示这些肿瘤细胞没有失去其免疫原性，T细胞仍然能识别这些细胞并发挥其攻击作用。但在原发肿瘤小鼠的体内这些T细胞却无能为力。
肿瘤常常被认为是慢性炎症的结果，这种炎症可引起局部和系统免疫抑制，从而不利于T细胞发挥其有效的功能。而且，肿瘤常表现为树状突细胞（DC)功能缺失，导致T细胞启动缺损。例如，在MMTV-PyMT乳腺肿瘤小鼠模型中发现，原本具有潜在激活抗肿瘤T细胞的DC细胞，会被大量存在的巨噬细胞竞争抑制，这些巨噬细胞起到了阻止特定T细胞激活的作用。最近的研究也证实，促进DC细胞功能或阻止骨髓细胞引起的免疫抑制，可以达到改善免疫检查点抑制物的抗肿瘤效果。因此，对肿瘤病人实施耐受T细胞免疫激活疗法的时候，结合应用针对改善免疫抑制或则增强T细胞启动的靶点药物，在临床上可能会起到更好的治疗效果。
相对于肿瘤接种模型，应用GEM模型进行免疫治疗研究需要不同的方法。考虑到GEM模型中肿瘤是在每个独立小鼠体内发生的，如同病人肿瘤的发生过程，具有特殊的肿瘤抗原。因而，具有其异质性的特点，从而确保区别鉴定反应和非反应肿瘤之间的分子不同，也有助于临床预测的生物标记物的建立。然而，对于大多数GEM模型来源的肿瘤来说，辨认可被T细胞识别的表达肿瘤抗原却是未知的。为了克服这点，可借助基因修饰的方式，将临床上相关肿瘤抗原引入小鼠体内，使其具有诱发肿瘤特异性T细胞反应的效果。比如，应用低免疫原性的肿瘤（如肉瘤和肺癌），将肿瘤特异性抗原引入至GEM模型后，这些肿瘤的免疫原性增加，引起潜在而短时间的抗肿瘤T细胞反应。起初的抗肿瘤T细胞反应很快发生，然后是可调控T细胞介导的免疫抑制。因此，这些模型将有助于目前与未来相关研究，以达到揭示免疫逃逸的复杂机制，最终研发具有改善的肿瘤免疫治疗的新策略的目的。
9. 与临床试验并行的GEM模型
最近推出的“与临床共试验” 范例，目的是将临床前GEM实验与人体临床试验同时开展，从而达到预测治疗效果的作用。该策略已经应用于前列腺癌治疗中，并成功揭示了由雄性激素诱发的耐受性与某些遗传关键因子有关，以及克服去势难治性的新综合疗法。同样，应用NSCLC的GEM模型的一起临床试验表明，Kras/Lkb1突变肺癌较Kras or Kras/p53突变肿瘤对临床上的Docetaxel和MEK抑制剂Selumetinib的联合疗法，表现为更加具有耐受性。揭示了LKB1是临床试验中对此类药物联合疗法耐受的潜在决定因素。这类研究表明，应用GEM模型作为人肿瘤临床前药物效果研究，能发现新的生物标记物和联合疗法。
GEM在肿瘤学研究中发展趋势与未来展望
许多抗肿瘤药物在临床试验中未能达到临床前实验的期望目的，已经成为目前肿瘤学与转化癌症医学所面临的巨大挑战，如何改善肿瘤学领域的临床前研究结果的预测性，也是人们十分关注的热点。因此，如何选择更能真实反映人肿瘤疾病发生发展过程的临床前肿瘤动物模型，将显得更加重要了。为了实现这一目的，首先需要考虑的是如何建立能真实反映肿瘤本身及外在特征的临床前小鼠模型。比如，临床前模型应该含有病人特异性突变，该种突变具有诱发恶性肿瘤的趋势，且在一定病人群中显示遗传变化特征。另外，原发的肿瘤过程是在自然微环境中进行的，如同在人肿瘤进行过程中所见的肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用（包括免疫细胞，成纤维细胞，以及淋巴细胞和血管的潜入）。再有，由于绝大多数进入临床试验的病人已经是处于广泛肿瘤转移疾病过程中，因此，实验设计时就应该考虑选择能模拟病人疾病不同进程状态的小鼠模型，开展相应的临床前的药物效果评估研究。在现实的临床试验中，往往进入临床试验的病人之前多是经过不同程度的治疗，因而极有可能会干扰治疗效果的验证。而临床前的动物研究则是建立在从来没有接受任何治疗的基础上进行的，从而导致高估治疗效果的结果。从另外一方面讲，临床试验中对那些接受过治疗的严重病人没有效果，却仍有可能对没有接受过治疗的严重病人有益处。
最近基因修饰模式动物技术的进展，促进了快速研制更加精准的能引起原发肿瘤的小鼠模型，该类模型结合了特异性肿瘤病人形成发生发展过程中肿瘤细胞本身和细胞外的特征。预测这些新一代的GEM模型和基于GEM模型的移植模型，将是真实模拟病人肿瘤发生发展过程，研究自发性转移疾病的最佳模式动物。这些模型可作为研究肿瘤形成的复杂过程（包括肿瘤的起始，器官特异性转移的形成，肿瘤微环境的参与等方面）的重要而有用工具。但是，对于肿瘤病人而言，更加重要的是，这些模型能更为深入地揭示免疫治疗中的反应性与耐受性，以及疾病的复发等相关机制。期待未来，应用新一代GEM模型对抗肿瘤新药物临床前的评估研究，将会增加预测其在临床试验中的成功率，从而加速抗肿瘤新药策略设计与临床实施，达到改善防治肿瘤病人的病情的最终目的。
作者简介
俞晓峰博士，国际知名模式动物和细胞生物学专家，先后就任于耶鲁大学医学院、iTL基因打靶公司和纽约大学医学院以及美国ASC生物技术公司等机构，在遗传修饰模式动物领域有超过20年的研发和管理经验。目前任职于赛业生物科技，任高级副总裁和高级科学家，主要负责基因修饰模式动物平台的技术工作，其研究成果多次发表在Nat Immunol、Mol Cell Biol等高水平杂志上。
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