人源化小鼠模型在人类疾病研究中的应用（三）
中国实验动物信息网：人源化小鼠在肿瘤生长和癌症免疫学等研究领域有哪些方面应用？
俞博士：在过去的50多年时间，研究者们通过将来自病人肿瘤移植到无胸腺裸鼠及SCID免疫缺陷小鼠的研究方法，已经成为验证与评估人癌症疾病治疗效果方面非常有价值的工作。不幸的是，无胸腺裸鼠仍然保留了小鼠的先天免疫系统和B细胞，特别是保留能抑制肿瘤生长和转移的小鼠NK细胞。而包括缺失NK细胞的免疫缺陷IL2rg小鼠的建立，则有利于成功移植各种人肿瘤，包括肿瘤细胞系，原位实体瘤及血液系统肿瘤等领域的研究及应用。
肿瘤病人来源的异种移植（PDX）至免疫缺陷IL2rg小鼠，可以实现保留原位肿瘤的异质性和基质效果。由于PDX小鼠中存在有人肿瘤侵润免疫细胞，该模型成为肿瘤微环境中的非自发的异质性现象的贡献之一。因此，免疫缺陷IL2rg小鼠为研究肿瘤与免疫系统相互作用提供了机会，研究者们可以通过移植人肿瘤细胞及免疫系统至免疫缺陷小鼠，探索肿瘤是如何与免疫系统相互作用，肿瘤免疫逃逸的机制，免疫调节潜在疗法的机理。当然，PDX肿瘤经过再次传代后，迅速损失原肿瘤基质，而被小鼠基质细胞所替代。
基于肿瘤细胞系在人源化小鼠模型而获得的肿瘤及免疫系统相互作用的相关结果，由于其缺乏肿瘤异质性等因素，因而存在一定的应用局限性。而进一步改进的肿瘤模型如PDX肿瘤模型则有助于解决这方面的不足，因为原位移植的PDX肿瘤模型可以实现肿瘤组织的异质性与更加完整肿瘤微环境相结合的目的。
然而，如何获得足够量的自体同源的HSCs开展大批量的研究，则是构建人源化小鼠应用于PDX研究中一个潜在不利因素。最近，一种从脐带血或G-CSF刺激并转染tat-MYC和tat-Bcl2融合蛋白的PBL，分离获得扩增的HSCs的方法，可以在体外扩增HSCs。如XactMice，
即将经体外扩增的HSCs移植的NSG小鼠，
再移植来自头颈部体鳞状细胞癌（HNSCC）病人的PDX样品，肿瘤在此类小鼠中有人CD45阳性CD151阳性细胞，以及增加的淋巴血管密度，提示在小鼠的肿瘤微环境中人免疫细胞和基质细胞已经再生形成。
人源化小鼠应用T细胞编辑方面的研究也已成为现实。一种通过作用于免疫系统达到改善抗肿瘤免疫的机制，是通过导入TCR或嵌合抗原受体（CAR）基因改造T细胞方法，达到重新提升T细胞特异性的T细胞疗法。CAR疗法是基于构建针对特异性抗原T细胞受体，该抗原受非依赖于MHC限制，使得TCR被引导至选择的任何靶点。虽然，T细胞再定位的疗法已经用于临床，人源化小鼠模型则可作为优化TCR/CAR调节的药效及安全，以及扩大癌症治疗范围等的评估方法。
将肿瘤特异性TCR通过转基因（Tg)
方式导入T细胞的优化机制，已经在人源化小鼠模型进行了研究。关于Tg TCR疗法的安全性考虑问题，是Tg
TCR与内源性TCR之间可能发生错误配对，引起脱靶特异性，从而增加了细胞毒性。有研究者利用ZFN方法将内源性TCRa和TCRb基因破坏后，表明在移植源WT-1阳性白血病的Hu-PBL-SCID模型中，编辑的Tg
T细胞具有只表达WT-1肿瘤特异性TCRs。
人源化小鼠也可作为免疫检查点抑制剂的评价工具。利用检查点抑制剂的作用机制作为肿瘤免疫调节疗法，已经成为当前最具潜力的研究领域。
目前在临床上成功研制的两个免疫检查点单克隆抗体，如抗细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）单抗，
该抗体具有阻断抑制通路，激活T细胞的作用；和抗程序化细胞死亡-1（anti-PD-1)单抗，可以达到阻断PD-1与其程序化细胞死亡-配体1（PD-L1）相互作用。这些阻断作用在抵抗黑色素瘤方面都具有明显效果，但不是所有的病人对CTLA-4和抗PD-1治疗都有反应。因此，移植肿瘤的人源化小鼠被应用，可以成为更好地揭示阻断与免疫系统之间的相互作用机制，以及测试与评价免疫调节剂效果与效率的工具。
最近的研究表明，应用人源化小鼠分析免疫调节抗体的药物动力学，以及抗肿瘤的特性，如在人结直肠HT-29癌细胞和异源人PBMCs移植的Rag2
IL2rg小鼠中，或移植病人来源的胃癌组织及自体PBMCs的小鼠，利用抗hCD137和抗PD-1单抗联合作用具有显著降低肿瘤生长的效果。
中国实验动物信息网：应用基因修饰方法建立人源化小鼠模型有哪些基本技术方法？赛业模式生物在这方面有什么优势与贡献？
俞博士：前面介绍的人源化小鼠模型多是基于免疫缺陷小鼠基础上，通过移植人细胞和组织实现的。通过基因修饰的技术方法，将人相关基因直接替换小鼠相关基因，建立人源化小鼠模型的方式，也已广泛应用于人基因功能研究、肿瘤免疫药物研发、感染性疾病建立以及药物临床前评估与考核等生物医药领域研究。比如，通过对免疫检查点相关的小鼠基因（如CTLA4和PD1等）进行人源化修饰，构建能与抗CTLA4和PD1人源化抗体相互作用的人源化小鼠，为这类抗体药物的临床前筛选与评估提供了有效的工具。通过对不感染小鼠，但感染人病原体感染分子机理的研究，探索建立可被这些病原体感染的人源化小鼠模型，为在小鼠体内研究其发病过程，建立有效疾病的防御与治疗评价体系提供了可能性。如基于对引起中东呼吸道综合症（MERS)的冠状病毒感染人细胞的分子机制研究的基础上，利用基因打靶技术，将冠状病毒感染结合人细胞DPP4基因替换小鼠的相应基因，构建了人源化DPP4敲入小鼠，研究表明，该人源化小鼠对冠状病毒具有易感性，并可作为筛选评估MERS相应中和抗体效果的工具。
另外，近年来在人源化抗体制备的快速发展中，利用基因修饰的方法构建可制备人抗体的人源化小鼠，已经成为抗体药物研发的重要研究领域。其中最为成功的例子为美国Regeneron制药公司研发的VelocImmune小鼠。该人抗体人源化小鼠的制备策略是通过多轮基因打靶操作过程，分别用人抗体重链/轻链可变区替换小鼠同源区域获得。该人源化小鼠在受到相应抗原刺激后，可生产针对特异性抗原的含人抗体可变区部分，以及小鼠抗体恒定区的人源化抗体。研究表明，与其他体外DNA重组方法获得的人抗体比较，这类通过人源化小鼠筛选获得人抗体具有更佳有效的亲和力与活性。
目前，应用基因修饰的方式构建人源化小鼠模型的技术方法主要有以下几种，1. 借助原核注射的方法，将人基因导入小鼠体内，达到表达人基因的目的；2. 利用小鼠ES细胞系，进行传统基因打靶的方法，达到用人基因定点替换小鼠基因或插入人基因的目的；3. CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过原核注射方式，构建特殊目的的人源化小鼠模型；4.
Turobo
KO优化的ES打靶技术，该技术是赛业生物对传统ES打靶技术进行优化，使其在构建人源化小鼠模型的研制中更加高效稳定。由于以上几种技术方法都有其各自的优势与不足，因此，在实际应用中，需要根据各自的研究需要与目的选择更加适合方法。比如，虽然原核注射的转基因构建方法本身方便，快速，成本低，但因DNA随机插入的特性，可能对内源性基因干扰引起的风险，以及插入位置效应对基因表达的可能抑制影响，可能导致对以后研究带来的不确定性因素。传统基因打靶技术因其成熟性与稳定性，一直都是基因修饰小鼠制备的金标准，然而，由于该方法技术要求较高，操作步骤多而复杂，使其制备周期相对较长，也不利于其推广应用。CRISPR/Cas9技术因其设计与操作相对简单，对一般基因修饰的效率高，且没有物种限制的特性，大大促进了其在人源化模式动物模型的研制。当然，因为存在脱靶效应，以及对复杂修饰效果难控制等风险也在一定程度上限制该技术等应用。在传统ES打靶技术的基础上，赛业生物经过多年的探索努力，推出的Turobo
KO基因打靶技术，包括建立生殖遗传高效的TetraOne
ES细胞系，以及Neo抗性筛选基因自删除系统等技术改进，不仅保留了传统基因打靶技术的稳定性与成功率，而且提高其制备过程的有效性，使ES打靶技术的制备周期大大缩短。因此，赛业生物Turobo
KO基因打靶技术的建立，将更加有助于构建相对复杂的基因修饰人源化小鼠模型，为应用基因修饰技术制备不同类型的人源化小鼠模型提供了更多的选择。目前，Turobo
KO基因打靶技术的建立也是赛业生物有别于其他同类供应商的明显优势之一。
中国实验动物信息网：人源化小鼠模型的研究与应用未来需要解决的问题是什么？
俞博士：对建立在免疫缺陷小鼠基础上的人源化小鼠模型需要从以下几个方面进一步的改进与优化，1.
降低小鼠的先天免疫，使其达到更加有效的移植具有功能性的人细胞，组织和免疫系统，表达人分子，如能于供体人细胞相配的HLA等位基因，从而更加有利于人免疫发育和功能；2.
构建有助于免疫缺陷IL2rg小鼠的人相关淋巴结构（如含生发中心的淋巴结）发育，使人造血干细胞成为发挥完整功能性人免疫反应；3.
研究寻找与替换人免疫系统形成相关的特异性因素，因为这些因素可能是小鼠自身缺乏的，但却是理想人细胞分化与功能需要的；4.
进一步评估与验证PDX和PDX/免疫模型应用实际效果，使其实现能真实反映病人肿瘤微环境与免疫系统相互作用的机制，为探索新的有效肿瘤免疫治疗方法与策略提供依据和基础；5.
由于移植物抗宿主疾病在许多人免疫移植模型中都会发生，因此，建立降低或防止移植物抗宿主疾病发生的有效方法，为人源化小鼠模型作为有效的临床前研究的工具，以及未来新药开发与应用创造了条件。
而对于基因修饰人源化小鼠模型研制，如何筛选到合适有效的相关靶基因，对修饰靶基因自身的结构，剪切及表达特点的深入了解，基因修饰打靶策略的选择，以及对目前不同基因修饰技术与方法的改进与优化等因素，都将是基因修饰人源化小鼠模型未来需要探索解决的问题。
总之，人源化小鼠模型等建立促使了人感染性疾病，癌症，再生医学，移植与宿主，过敏和免疫等领域的研究发展。利用人源化小鼠模型最终有可能实现临床上真正“个性化” 医疗的目的。
中国实验动物信息网：非常感谢俞博士接受中国实验动物信息网的特邀专访。
来源: 中国实验动物信息网
