真菌总 RNA 的制备
试剂、试剂盒 酚氯仿异戊醇 12mol L 氯化锂 3mol L 乙酸钠 乙醇 DEPC 处理的水
仪器、耗材 水浴 低温高速离心机
实验步骤
一 材料与设备
1) 酚：氯仿：异戊醇 (25：24:1)。
2) 氯仿：异戊醇 (2：1)
3)12mol/L 氯化锂。
4)3mol/L 乙酸钠。
5)70% 乙醇。
6)DEPC 处理的水
7) 水浴。
8) 低温高速离心机。
二 操作方法
1) 在装有液氮的研钵中研磨 2〜5 g 真菌组织，直至完全变成粉末。
2) 把研磨好的粉末转移到 Falcon 管中，管中装有提取缓冲液 (每克真菌用 3 mL 提取缓冲液）及等体积酚：氯仿：异戊醇 (预热到 65℃）
3) 振摇试管以彻底混合。
4) 把混合物转移到一个无 RNase 的离心管中，以 13000〜18000 g 于 4℃ 离心30 min
5) 收集上层水相，加入等体积的氯仿：异戊醇 (24:1)，翻转混匀。
6) 以 1300〜18000 g 于 4°C 离心 30 min。
7) 收集上层水相，加入 12mol/L 氯化锂至终浓度髙于 2mol/L。
8) 混合后于 4℃ 过夜以沉淀 RNA,
9) 以 13000〜18000 g 于 4℃ 离心 30 min
10) 去上淸，以 5 ml3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 清洗沉淀，按第 9) 步离心 15 min
11) 去上清. 以 20 ml70% 乙醇清洗沉淀，再按第 9) 步离心 I5 min。
12) 用 70% 乙醇重复冼涤一次。
13) 真空干燥以去除乙醇，
14) 以适当体积（250〜lOOOul)DEPC 处理的水溶解沉淀。
15) 溶解的 RNA 于-70°C 保存。
注意事项
1) 将研磨好的真菌转移到 Falcon 管中时，要小心操作以避免损失. 所有操作都应该迅速，样品/试管尽暈放在冰上以降低 RMase 的作用。
2)65℃ 加热可帮助 RNA 溶解。如果有不溶颗粒，可于 13000〜18000 g 离心 2 min, 收集上清，沉淀中部分或极少含有 RNA 或不含RNA.
