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对培养的NK-92mi细胞不满意，究竟哪里出了问题？

2021.5.31

关于NK细胞培养的问题，不能只认为培养基不好或试剂盒不好，很多客户在培养过程中遇到接种密度的问题、补液程序的问题、血浆问题以及样本的问题，所以影响NK细胞培养效果的因素非常之多，那么在细胞培养不太满意的情况下，我们应该按以下原则进行排查。

1、血液样本问题

首先确认样本的状态，理论上来讲外周血样本应在抽取的6个小时内进行细胞分离，这个时段细胞是处于H的状态，所以培养前请确认样本是否新鲜，以及血液是否出现溶血现象

血液样本保存时间过长，会导致单核细胞无法成功诱导激活。

血液如在运送过程中溶血，则可能导致血浆分离出现问题，无法后期培养添加。

如用冻存的单个核细胞复苏培养，请确认复苏单个核细胞的活率及状态。

2、接种密度问题

请确保接种的密度在1.5-2x106cells/m L，过低密度会导致细胞前期增殖缓慢，无法达到补液要求。

3、血浆的处理及添加方式

（1）血浆必须要56℃灭活30min，除去多余的纤维蛋白，如有可能冷冻后离心，保证细胞培养时添加的血浆不会有纤维蛋白析出粘连正常细胞。

（2）如有可能有更多剩余的血浆，可在后期补入，对于有些状态较差的样本会有更好的培养效果。

4、补液原则问题

NK培养受样本差异性影响会很大，所以没有一个固定的补液程序可以指导各种不同的样本。

有的样本激活迅速，生长快速，补液就相对容易，也更好扩增，可有的样本前期就长的较慢，如遇到肿瘤患者晚期年老的病人，更是难上加难，所以针对不同的样本，我们应该有不同的应对原则：

（1）首先7天以后的补液原则是补液后细胞密度应在0.5-0.8x106cells/m L，如密度达不到，请延迟一天后再进行补液，否则当你细胞补液密度过低时，好的样本可以长起来，那差的样本就会逐渐凋亡，无法继续培养。

（2）对于差的样本，适当增加血浆的添加次数，可以得到更好的效果，比如标准程序需要加3-4次血浆，那么有可能的话你可以加到5次。

5、操作原因

（1）补液培养基的温度

培养基补液前应提前预温，过冷的培养基会导致细胞应激反应，出现絮状物；

（2）培养箱环境的剧烈变化

培养箱异常，温度及二氧化碳浓度变化较大会导致细胞死亡，出现絮状物；

（3）细菌、真菌、支原体污染

受到细菌、真菌、支原体污染的细胞生长非常缓慢，甚至不生长；

（4）因子试剂盒经过了反复的冻融

反复冻融会大大降低因子的活性，激活、诱导、扩增等环节都会出现问题，达不到You的效果。

细胞

丁香通

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