总RNA分离纯化标准操作
实验概要
本实验介绍了总RNA分离纯化标准操作规程(SOP)。
实验原理
氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。
异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。
氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
主要试剂
1. Trizol试剂（购自Invitrogen公司）
2. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)
3. 氯仿（新开封）
4. 异丙醇（新开封）
5. 无RNase灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（250℃ 3小时）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
6. 75%乙醇：用DEPC处理后的水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于4℃冰箱。
主要设备
1. 研钵
2. 恒温水浴锅
3. 旋涡振荡器
4. 冷冻台式高速离心机
5. 超低温冰箱
6. 紫外检测仪
7. 电泳仪
8. 电泳槽
实验步骤
1. 匀浆
1) 从组织中提取总RNA、
a. 液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按照每50~100mg组织加入1ml Trizol，转入离心管进行下步操作。
b. 匀浆：用电动匀浆器充分匀浆1~2min。注意，组织样品体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好。
2) 从培养细胞中提取总RNA
a. 粘壁培养细胞：不需蛋白酶消化，先将培养基去除，然后直接将Trizol加入到培养瓶中消化、裂解细胞，Trizol体积按250px2/ml的比例加入。
b. 悬浮培养细胞：直接离心收集细胞后用Trizol重悬、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106个动物、植物或酵母细胞，或1×107个细菌细胞。注意，在加入Trizol之前不能用其他缓冲液洗涤细胞，那样会增加 mRNA降解的可能性。另外，在裂解酵母或细菌细胞时可以借助匀浆器。
2. 相分离
1) 匀浆组织加入Trizol后，室温放置 5min，使其充分裂解。注意：此时可以放入-70℃长期保存。
2) 室温，12000 r/min，离心5 min。取上清于一新管。
3) 按照1ml Trizol加入200µl氯仿，用手振荡混匀后室温放置2~3 min。注意：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
4) 4℃，12000 r/min，离心15 min。小心吸取上层水相于一新管。注意：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱中，如只提取RNA，则弃下层酚相。
3. RNA沉淀
1) 按照1ml Trizol加入异丙醇0.5 ml，混匀，室温放置5~10 min。
2) 4℃，12000 r/min，离心15min。弃上清，RNA沉淀管底。注意：RNA沉淀在离心之前是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球。
4. RNA洗涤
1) 按照1ml Trizol加入1ml 75%乙醇，震荡离心管，悬浮、洗涤沉淀。
2) 4℃，8000 r/min，离心5 min。尽量去除上清。
3) 室温晾干，或者真空干燥5~10 min。注意：RNA沉淀不要过于干燥，否则将会降低它的溶解度。
5. RNA溶解
1) 用50µl ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS溶解RNA沉淀，然后于55~60℃温育5~10 min。注意：ddH2O，TE Buffer（pH7.5），或者0.5% SDS 均必须用DEPC处理并高压灭菌；另外，如果RNA后面要用于限制性内切酶分析，则不能用0.5% SDS 溶解。
6. RNA质量检测
1) 完整性：琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。Trizol试剂可以很容易地分离所有种类的RNA。例如利用Trizol分离老鼠肝脏总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在7~15kb处，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不连续的带状分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有两条主要条带，而在0.2kb处则是小分子RNA（tRNA和5S）。
2) 纯度分析：计算A260/A280的比率。利用Trizol试剂提取的RNA，其A260/A280比率为1.6~1.8，如果用TE溶解，则A260 /A280大于1.8。
3) 浓度和产量分析：测OD值，定量RNA浓度，计算产量。
注意事项
1. 塑料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已经标明RNase-Free的塑料制品，如果没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1) 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物质，活性很强，应在通风橱中小心使用。
2) 将需要处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3) 在通分橱中室温处理过夜。
4) 将DEPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含有已用DEPC水处理过的塑料制品的容器，高温高压蒸汽灭菌至少30 min。
5) 在烘箱中用合适的温度烘烤至干燥。置于干净处备用。
2. 玻璃和金属制品
先用去离子水将器皿清洗干净，晾干，用铝箔包好，然后至烘箱中250℃烘烤3 小时以上。
