2b-RAD基因分型样品的制备
实验概要
本实验介绍了2b-RAD基因分型样品的制备流程。
主要试剂
ALFI（(Fermentas, cat no. ER1801）
T4连接酶（NEB, cat no. M0202）
ATP（NEB, cat no. P0756）
DNA聚合酶（(NEB, cat no. M0530）
dNTP（NEB, cat no. N0447）
琼脂糖
所有的连接子和寡核苷酸引物购于 IDT。
实验步骤
1. 酶切
1) 准备完整，高质量的基因组DNA样本，每个样本含量为1µg，在高浓度(至少250 ng µl-1)。用无核酸水稀释所有样品至相同体积(4μL)。
2) 通过将以下物质加入一个试管中混合，获得酶切混合物。这里所指体积为单一一个反应的体积，因此乘以样本数，再多加上一些避免吸取导致的误差。
0.6μL 10×缓冲R
0.4μL 150μM的SAM
1.0 U AlfI
加入无核酸水(NFW)至总体积2.0 µl
3) 将 2μL酶切混合物与 4μL DNA样品混合，并在37°C孵育1小时，然后在65℃灭活酶20分钟，保持样本在冰上。
2. 接头连接
1) 准备2份双链接头，都用终浓度为4μM的寡核苷酸绑定，通过SLD- ada1-ALFI和反SLD- ada1连接准备接头1，通过SLD- ada 2 AlfI和反SLD- ada2相连接准备接头2。
2) 将下列物质混合在一个试管中来制备连接混合物，这里列出的体积为单一一个的反应体积，因此根据需要扩充体积。
0.5μL 10 mM ATP
2.0μL 10× T4连接酶缓冲液
2.5μL 5μM的接头1
2.5μL 5μM 的接头2
11.5μL NFW
3) 将5μL消化的DNA与20μL酶切混合物混合。孵育1小时(热灭活酶，16°C如ALFI，或未灭活酶，4°Ç，如BsaXI)，放置冰上。
条形码插入
1预试PCR确定最低循环数，并评估样品的相对产量。通过以下成分混合在一个试管内准备一份PCR酶切混合物。这里列出的体积为单一一个的反应体积，因此根据需要扩充体积。
6.5μL NFW
2.5μL 2.5 mM dNTP
0.4μL 10μM SLD-P5
0.4μL 10μM SLD-P6
1.0μL 1μM SLD-P3
1.0μL 1μM SLD-P4 (条码码)
4.0μL 5× HF缓冲区
0.2μ 聚合酶
2) 每个样本将16μL酶切混合物与4μL接头子混合，应用以下程序：(98℃ 5秒，60℃ 20秒，72℃10秒) × 12个循环。
3) 每个反应5μL样品，两个循环时间间隔(N = 6，8，10，及12个循环)。每个采样间隔期间，可以暂停热循环。
4) 凝胶电泳(2％琼脂糖TBE缓冲凝胶)检测PCR 产物，使用小分子量的 marker。要求PCR产物大小〜130 bp，选择循环的最低数。
5) 通过将以下成分混合来准备PCR反应的酶切混合物。这里列出的体积为单一一个的反应体积，因此根据需要扩充体积。
32.5μL NFW
12.5μL 2.5μM dNTP
2.0μL 10μM SLD-P5
2.0μL 10μM SLD-P6
5.0μL 1μMSLD-P3
5.0μL 1μMSLD-P4(条形码)
20.0μL 5×HF缓冲液
1.0μ 聚合酶
6) 将80μL酶切混合物与20μL接头子混合，并根据第4步确定使用最佳循环次数扩增。
凝胶纯化
1) 2％琼脂糖凝胶，使用标准的电泳方法和标记物。
2) 设置紫外透射为低强度，观察目标条带(〜130 BP)，限制每个样品的紫外照射不超过30秒。
3) 从凝胶中切下所得条带，准备提取：
a. 根据你所选择的胶提取试剂盒，根据说明提取
b. 将胶直接放入水中洗脱(1.5 ml离心管中40μL NFW)，在4°C过夜，到第二天早上收集洗脱液。
4) 从每个准备液和混合液中收集小片段(2-10µl)，然后测序。剩下的准备液可以20°C保存6个月。
