IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤-2
2 ）超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 ％ 溴酚蓝
20 ％ 甘油
实验方案
1、外源基因的诱导表达
( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，
确定无误后进行下一步。
( 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
( 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 ）细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：
① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
