正常人原代角膜间质细胞的分离
正常人原代角膜间质细胞的分离
实验材料：
1.完整的人角膜；
2.GMF-Saline G；
3.中性蛋白酶Ⅱ；PriCellls原代细胞分离试剂盒
4.L型胶原酶，1mg/ml在DMEM/F12/GA中；
5.GMF-Saline G配制的TrypLE Expre或0.25%胰蛋白酶；
6.DMEM/F12/GA；
7.DEME/F12/2FB/GA：DMEM/F12/GA含2%F；
8.CMF/GA；
9.3.5cm塑料组织培养皿或6孔板；
10.手术刀或单刃的安全刀片；
11.细胞滤网，70μm血液尼龙过滤网；
12.塑料刮片，“Cell Lifter”或“Cell Scraper”；
13.弯虹膜剪，11cm（4-3/8in）；
14.Jeweler&rsquo镊，10cm（4in）；
15.角膜剪，19mm刀刃，尖头；
16.Colibri缝纫钳，0.1mm；
17.DS样本缓冲液，使用终浓度：0.058mol/L Tris，5%丙三醇，1.67% SDS，0.02%溴酚蓝；
18.原代细胞特制基础培养基；
19.原代细胞培养特制添加剂；
实验方法：
1.用GMF-Saline G清洗角膜3&time5min；
2.剪除残留的巩膜，结膜和虹膜；
3.加入原代细胞分离试剂盒的试剂，4℃摇床摇动过夜；
4.将加入试剂的角膜4℃摇30min；
5.用DMEM/F12/GA清洗角膜；
6.解剖显微镜下，小心去除上皮和内皮细胞；
7.用塑料刮片轻刮基膜的上皮细胞面和内皮细胞面。显微镜下观察，以确保完全去除这些细胞层；
8.用新鲜培养基清洗角膜基质一次；
9.用手术刀或安全刀片或精细手术剪将基质剪碎成2mm左右的小块；
10.用DMEM/F12/2FB/GA配制的胶原酶37℃消化3h，直至大多数组织消失；
11.400g离心10min，弃上清；
12.用DMEM/F12/2FB/GA重悬细胞，用70μm细胞滤网过滤消化液，并离心；
13.重复上述清洗步骤2遍，每遍之后细胞计数；
14.用MJM将分离出的间质细胞重悬并以1&time104/cm2的密度接种至塑料组织培养皿；
15.每三天更换一次原代细胞特制基础培养基＋原代细胞培养特制添加剂；
16.当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代。
