中性蛋白酶制剂包埋法介绍
摘 要
用海藻酸钠、单硬脂酸甘油酯作壳材料，氯化钙作固化剂，对中性蛋白酶制剂进行了包埋研究，结果表明，在100 ml、0.7%的海藻酸钠溶液中加入0.5 g单硬脂酸甘油酯，10 g中性蛋白酶粉，滴入1%的氯化钙溶液中固化5 min，经干燥、涂膜能明显提高抗胃蛋白酶分解能力和耐胃酸能力。
关键词 中性蛋白酶；包埋；能力
中图分类号 Q814.2
研究表明添加酶制剂可以提高家禽生产性能,降低饲料成本,减少环境污染,提高蛋品质等。酶制剂作为绿色饲料添加剂,使用越来越广泛,国外甚至已将酶作为家禽日粮的常用成分。但饲用酶制剂本质是蛋白质,pH值苛刻,酶易失活,易被胃内蛋白酶分解。将酶制剂进行包埋后,能提高酶制剂的抗酸性和耐高温能力。
在pH值小于4.0时中性蛋白酶基本上不表达活性，而家禽的腺胃和肌胃内pH值在2.5～4.0之间。为提高中性蛋白酶在饲喂过程中的利用率，我们对饲用中性蛋白酶包埋进行了研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 中性蛋白酶来源及缓冲溶液的配制
中性蛋白酶是陕西省科学院酶工程研究所的发酵液经喷雾干燥产品（100 000 U/g）。磷酸缓冲溶液(pH值7.5)：称取6.02 g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和0.5 g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O），加蒸馏水溶解并定容至1 000 ml。
1.1.2 显色剂制备
于500 ml回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)10 g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）2.5 g、水70 ml、85%磷酸5 ml、浓盐酸10 ml，小火沸腾回流10 h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）5 g、水5 ml和数滴浓溴水（99%），再微沸15 min，以除去多余的溴，冷却，加水定容至100 ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色。
使用时，应将上述溶液与两份水混合，摇匀后再使用。
1.2 试验方法
1.2.1 酶活性检测方法
取试管A(空白)、试管B(3个平行样)。在试管A中加入酶液1.00 ml，(30±0.2) ℃水浴2 min后加三氯乙酸2.00 ml(摇匀),(30±0.2) ℃水浴10 min后加1%酪素溶液1.00 ml，静置10 min；取滤液1.00 ml，加0.4 mol/l碳酸钠溶液5.00 ml、显色剂1.00 ml，（30±0.2） ℃水浴显色20 min，于680 nm波长处测其吸光度。在试管B中加入酶液1.00 ml，(30±0.2) ℃水浴2 min后加1%酪素溶液1.00 ml，(30±0.2) ℃水浴10 min后加三氯乙酸2.00 ml(摇匀),静置10 min,取滤液1.00 ml,加0.4 mol/l碳酸钠溶液5.00 ml、显色剂1.00 ml，（30±0.2） ℃水浴显色20 min，于680 nm波长处测其吸光度。
1.2.2 酪氨酸标准曲线的制作
精确称取干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 0 g，用盐酸溶解定容至100 ml。取6支试管，用0.1 mol/l盐酸配制出的20、30、40、50、60、70 μl/ml的L-酪氨酸标准液。各取1.00 ml上述标准液，各加0.4 mol/l碳酸钠溶液5.00 ml、显色剂1.00 ml，置于（40±0.2） ℃水浴中显色20 min。分光光度计680 nm处显色。
1.2.3 酶制剂的包埋方法
A：取1%的海藻酸钠溶液100 ml，加入10 g蛋白酶，搅匀，用注射器滴入2%氯化钙溶液中固化5 min，取出晾干。
B：取1%的海藻酸钠溶液100 ml，加入0.7%的单硬脂酸甘油酯，溶解，加入10 g蛋白酶，搅匀，用注射器滴入2%氯化钙溶液中固化5 min，取出晾干。
C：取1%的海藻酸钠溶液100 ml，加入0.7%的单硬脂酸甘油酯，溶解，加入10 g蛋白酶，搅匀，用注射器滴入2%氯化钙溶液中固化5 min，取出晾干，涂肠溶膜。
1.2.4 酶制剂的活性评价方法
由于包埋方法不一样,制得酶样品单位重量的原酶含量不一样。为统一标准,先计算每种方法的原酶制剂百分含量a,每次检测称取样品的质量计为m,每次样品检测总活力计为U。单位比活力(U/g)=U/(m×a)。
2 结果与分析
2.1 包埋方法对酶活性影响试验
用3种方法制得的包埋样品与原酶样活性分析结果如图1。酶经过包埋后,活性均下降了20%左右。而3种包埋法对酶的损失率相差不大,其中B、C法略大。酶活性损失主要在海藻酸钠-蛋白酶混合物在氯化钙溶液固化过程中,酶分子溶入氯化钙溶液,因而在生产中应缩短固化时间。从A、B、C 3种方法制得的包埋酶活性相当来看,海藻酸钠加单硬脂酸甘油酯作壳材并不影响酶的活性;涂肠溶膜亦不太影响酶的活性。
将酶制剂加至95 ml 0.01 mol/l盐酸溶液中，同时加入100 U/ml的胃蛋白酶5.00 ml，保持60 min，检测酶活性如图2。原酶经加有胃蛋白酶的盐酸溶液浸泡60 min后，酶活性下降至原来的10%左右。而经过包埋的酶活性是原酶的50％~60%。C法经涂肠溶膜虽在图1中显示的活性最低，但经过加有盐酸胃蛋白酶的盐酸溶液浸泡60 min后，活性最高。
2.3 包埋方法对酶活性释放的影响（见图3）
从图3可看出，3种包埋方法得到的样品在缓冲溶液中经轻轻搅拌，在60 min后基本上能达到最大释放量。方法B得到的样品在缓冲液中添加胰脂肪酶的释放速度比不添加胰脂肪酶的速度略有提高。这说明胰脂肪酶能部分分解壳材中的单硬脂酸甘油酯，加快壳材崩解,从而加快酶的释放。C法得到的样品加入肠液和胰脂肪酶的释放速度明显提高,这表明肠液能明显溶解肠溶膜,使壳材裸露于缓冲液中,再加上胰脂肪酶的作用,60 min后基本能接近最大释放量。
3 结论
经初步研究得出:100 ml、0.7%的海藻酸钠溶液中加入0.5 g单硬脂酸甘油酯、10 g中性蛋白酶粉，滴入1%的氯化钙溶液中固化5 min，晾干得到的包埋酶抗胃蛋白酶分解能力明显增强,耐酸能力也明显增强。在试验操作过程中发现，在氯化钙溶液中固化时间不宜过长,以免酶分子扩散到溶液中过多,影响包埋率。
