病毒免疫荧光实验_病毒染色标本的制备
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| 实验步骤 | 1. 培养细胞小玻片标本的制备 根据所检测病毒种类，选择敏感细胞进行培养，如乙型肝炎病毒用乳地鼠肾细胞 (BHK21 细胞）培养，森林脑炎病毒用绿猴肾细胞 (Vero 细胞）培养，登革热病毒用白纹伊蚊传代细胞 (C6/36 细胞）培养。 按细胞培养方法，将其分装在有盖玻片的培养板或培养瓶中，置 37℃温箱培养成单层细胞，然后接种病毒。接种病毒量及培养时间因病毒种类而异。 如乙型肝炎病毒接种的病毒滴度为约 10-5, 培养 24 h 收片；森林脑炎病毒接种的病毒滴度为 10-6 ,24 h 收片；登革热病毒接种的病毒滴度为 10-6,48 h 收片。 设未接种病毒的正常细胞作对照。感染和对照标本从培养板或培养瓶中取出后用 0. 01mol/L PBS 漂洗 2 次，放滤纸上，干燥后放预冷丙酮中置- 30~-28℃冰箱中固定 30 min, 取出小片，室温干燥后装小瓶密封，置 4℃冰箱保存备用。 2. 鼻咽部上皮细胞涂片制备。患者先排净鼻咽部分泌物后，将蘸有生理盐水的鼻咽拭子顺下鼻道插入，擦拭鼻咽处或咽部扁桃体周围及前后咽壁，尽量获取上皮细胞，然后向清洁载玻片上轻压棉拭子，制成薄而均匀的涂片。每标本作 4-5 片，放室温晾干后，滴加冷丙酮置 4℃冰箱中固定 10 min, 室温下干燥后，置 4℃冰箱保存或立即染色检测。 3. 石蜡切片标本的制备从放血处死的小白鼠或尸检材料中，取鼠脑或其它组织材料，切3-4mm 小片，置 95% 乙醇中 4℃固定 24 h 。在 4℃下经无水乙醇 I、II容器内顺次脱水，每容器1 h 。再用二甲苯浸 15-30 min 至透明为止。将组织块放 56℃浸蜡 30 min, 制成蜡块，切片厚度为 6-8 µm。经二甲苯脱蜡， 95% 乙醇脱去二甲苯，再染色。具体方法同病理组织切片制备。蜡块可保存一年，经荧光染色仍保持抗原性和着色力。 4. 冰冻切片标本制备 将上述小白鼠按需要选择部位或尸检材料，切厚度为 3-5mm 小块，放冰冻切片机冷冻台上，用普通浆糊作支持物作冷冻切片，厚度为 4-7µm, 夏季室温超过20℃以上可用 60 g/L 明胶作支持物，也可将切片机置于 4℃卧式低温冰箱中进行。玻片粘片后立即放丙酮中，室温固定 10-15min, 即可荧光染色。 5. 鼠脑及尸检材料印片制备 (1) 热印片法：将载玻片通过酒精灯火焰数次，待温度达 40℃左右时取脑组织轻轻印片，放室温干燥，在室温中用丙酮固定 10 min, 即可进行染色。 (2) 冷印片法：将载玻片放-20℃低温预冷，也可采用乙醇加二氧化碳干冰降温。将材料迅速印片，立即放入干燥缸中干燥后，置丙酮中固定 10 min, 即可染色。 展开 |
| 注意事项 | （一）病毒染色标本的制备 标本的制作要求维持完整的抗原成分，细胞形态学变化尽可能小，抗原所在位置尽可能不变，不溶解扩散，不脱落。 （二）固定病毒标本所选用的固定剂应以既具有改变细胞膜的通透性使荧光抗体通过细胞膜与细胞内抗原结合又不破坏病毒的抗原性为原则，通常采用冷丙酮。 （三）标本在固定前一定要彻底吹干，否则在以后的操作步骤中，标本易脱落。 （四）冲洗时应使水流到标本上方，再流经标本，防止标本从玻片上脱落。 展 |
