关于细胞冻存你了解吗？
细胞培养技术创建于1907年，历经一个世纪磨练与升华，现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。小伙伴们要想在如今细胞培养技术广泛渗透的科学研究领域搞好科研，最基础的细胞株的冷冻保存和解冻复苏技术自然不能忽视。
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。
实验前准备：
1.材料准备：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降温机
2.冷冻方法理论准备:
(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-8O℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-8O℃冰箱中。
(2）程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
实验步骤：
细胞冻存步骤：
1.用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗1-2遍;
2.加入适量胰酶，置于培养箱中消化;
3.待消化到位后加入适量血清或完全培养基终止消化，800-1000rpm离心3-5min;
4.配制冻存液，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107 cells/mL，转移到冻存管中;
5.将冻存管放入程序降温盒中，-80度过夜，然后转移到液氮中保存。
6.冻存细胞后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，
为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存
注意事项
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80~90%致密度。
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
2.细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力﹔在-70度可保存数月。注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级，无菌且无色是直接购买无菌产品，以5~10m1小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
3.冻存细胞数量要足够。无论再怎么小心，细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以，一开始冻存细胞的数量要足够。一般要达到5× 10^6 /毫升，一瓶不够两瓶凑。但是，这个不能一概而论。有些细胞，比如杂交瘤细胞，只需要1-3x 10^6 /毫升
细胞复苏
1.操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
2.自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
3.将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
4.取出冷冻管，立即放入3℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以7O%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
5.取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15)，混合均匀，放入培养箱培养。取0.1m1解冻细胞悬浮液作存活测试。
6.解冻后是否立即去除冷冻保护剂，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。
惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10m1培养基之离心管内，离心 1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入培养箱培养。
注意事项
1.复苏速度越快越好。从液氮罐里取出来之后，迅速放在37°C水浴中，摇晃令其尽快融化。
2.解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡。
