铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又称绿脓杆菌，是引起急性或慢性感染的最常见的条件致病菌之一，由其引起的院内感染往往治疗难度极大，几乎具有目前已知的细菌主要耐药机制，已成为引起院内获得性肺炎多重耐药革兰阴性菌的代表。PA 感染是治疗的难题，归其原因，在于其广泛而多重的耐药性。因此，了解铜绿假单胞菌的耐药相关基因的情况，有助于临床研发更有效的治疗铜绿假单胞菌感染性疾病的抗菌药物。PA 的耐药机制概括起来主要有以下几个方面：各种外排泵系统的过度表达、外膜通透性的降低、药物作用靶位的改变、氨基糖苷类修饰酶的产生、细菌生物被膜形成以及产生抗菌药物灭活酶等。由于这些机制可以共存，故PA 往往具有多重耐药性。本文主要对上述几种耐药机制的相关耐药基因的进展作一综述。
一、与主动外排泵系统相关的耐药基因研究
铜绿假单胞菌药物是一种革兰阴性杆菌，其主动外排泵系统最早于1993 年被报道，具有编码超过50 个潜在多药转运体的能力。目前在PA 中已报道有MexGHIOprD、MexVW-OprM、MexPQ-OprE 和MexMN-OprM等9 种外排泵系统。其中，外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexJK-OprM 和MexXYOprM对PA 耐药性的作用已被明确证实。PA 的主动外排系统主要由3 部分组成：一是具有药物识别作用的内膜蛋白，如MexB、MexD、MexF 和MexY 等。二是可以将药物泵出菌体的外膜通道蛋白，如OprM、OprJ和OprN 等。三是起到连接作用的辅助蛋白，如MexA、MexC 和MexE 等。正是由于这些主动外排系统的存在，PA 对多种抗菌药物能够形成固有性耐药或获得性耐药。
MexAB-OprM 在PA 外排泵系统研究中最详实，其决定了PA 的固有耐药性。MexAB-OprM 包含3 个结构编码基因，在野生铜绿假单胞菌株中可表达。MexABOprM外排泵系统可转运包括β- 内酰胺类、喹诺酮类和大环内酯类等抗菌药物以及β- 内酰胺酶抑制剂等种类繁多的底物，使得PA 具有广泛的耐药性。MexAB-OprM 外排泵的关键特性是可将大量的β- 内酰胺类抗菌药物泵出菌体外。MexA 和（或）MexB 在该外排系统中起着至关重要的药物识别作用。β- 内酰胺类药物先经外膜进入膜间隙，然后被MexB 俘获，最后借助MexA 的桥接作用，经OprM 排出菌体外。在生理状态下，MexAB-OprM阻遏蛋白是mexR 基因编码的产物，当mexR 基因发生突变时，MexAB-OprM 可因脱离抑制而出现表达增强，形成获得性耐药。
MexCD-OprJ 在实验室条件生长的野生PA 菌株中，该外排泵系统通常不发生表达，但在nfxB 突变株中却高度表达。单一使用喹诺酮类药物治疗后有可能出现突变株的产生。MexCD-OprJ 外排泵可导致PA 对四代头孢、氯霉素类、四环素类和其他抗菌复合物的耐药。
MexEF-OprN 在nfxC 突变的PA 株中，此系统可发生高度表达。mexT 抑制OprD 基因表达的同时增加了MexEF-OprN 外排泵系统的表达，使细胞内通过OprD 通道进行渗透的抗菌药物的浓度出现普遍降低，从而导致PA 对碳青霉烯（主要是亚胺培南）类抗菌药物出现交叉耐药。
MexXY-OprM 该外排泵系统受mexZ 基因调控，mexZ 基因的突变可导致细菌对氨基糖苷类、氟喹诺酮类等耐药性的形成。MexJK-OprM 该外排泵系统由mexL 基因调控，可选择性暴露在三氯生下表达，可将四环素和红霉素泵出细菌体外。
MexVW-OprM 该外排泵系统的的编码基因为mexVW，该基因位于重组性质粒pTAJ2 上，该外排系统可介导PA 对氟喹诺酮类、四环素等产生耐药性。
多研究发现，各种类型外排泵的表达可呈现相关性，如外排泵系统MexAB-OprM 与MexCD-OprJ、MexEFOprN的表达呈现负性相关，临床分离所得的耐药PA 亦常常检出两种或三种外排泵同时高表达的状况。国内有学者对临床标本分离所得的80 株多重耐药铜绿假单胞菌株进行耐药表型检测发现，其中有80% 的菌株检出了不同类型外排泵基因。
二、与外膜通透性障碍相关的耐药基因研究
外膜上的孔蛋白通道或脂质通道是抗菌药物通过的桥梁。如果这些通道发生改变或缺失，抗菌药物的杀菌作用将受到限制，敏感性将大大降低，从而使耐药性增强。大量的研究表明，大部分革兰阴性杆菌具有高通透性的孔蛋白通道和相对较少的特异性蛋白通道，而铜绿假单胞菌外膜则存在着主要的特异性通道，如OprC、OprD2、OprE1 和OprF 等， 其中OprC、OprD2和OprE1 为小分子微孔蛋白，分子质量分别为70 kD、46 kD、43 kD，这些微孔蛋白形成的孔道渗透速度仅为其他多数革兰阴性杆菌的1%。而Bent 等研究结果表明，PA 中富含大孔通道蛋白OprF。但OprF 并不具备通透功能，这使得PA 外膜低通透性与大通道之间的矛盾得到解释。除此之外，特异性外膜通道的突变可以导致细菌耐药性的形成。如当外膜蛋白OprD2 的缺失或表达减少时，可引起PA 对亚胺培南耐药。有实验证明，对耐亚胺培南的PA 转入带有OprD2 编码基因的质粒后，PA 对亚胺培南的耐药性消失。因此，OprD2 被认为是亚胺培南进入PA 的通道。
三、改变药物作用靶位的耐药基因研究
当抗菌药物的作用靶位（如青霉素结合蛋白和DNA拓扑异构酶Ⅱ）发生改变时，可引起PA 对其耐药。青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）存在于PA 的内膜上，当其与β- 内酰胺类药物结合后会失去酶的活性，从而引起PA 死亡。因此，当PBPs 基因发生变异时，其与β- 内酰胺类药物的结合能力就会出现降低或者难以与此类药物发生结合，从而使PA 形成对该类抗菌药物的耐药性。当然，PA 亦可改变DNA 拓扑异构酶Ⅱ的结构而使其对喹诺酮类药物的敏感性消失。如当DNA旋转酶（DNA gyrase）的gyrA 基因或Ⅳ -topoisomerase的parC 基因此类细菌的靶位基因产生突变时，可引起铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药性的形成。
四、与氨基糖苷类修饰酶产生相关的耐药基因的研究
PA 可通过产氨基糖苷类修饰酶（aminoglycosidemodifyingenzymes，AME）而形成耐药性。这一途径是PA 对氨基糖苷类抗菌药物耐药的主要原因。除此之外，PA 亦可因其作用靶位基因的突变（如16S rRNA 基因的突变）而导致其对氨基糖苷类抗菌药物敏感性的消失。AME 由乙酰转移酶（acetyl transferase，AAC）、磷酸转移酶（phosphate transferase，APH）和核苷转移酶（nucleotidyltransferase，ANT）3 大类所组成。这些修饰酶相关编码基因有aac(3)- Ⅰ、aph(3 ＇ )- Ⅵ、ant(3 〃)- Ⅰ等30 余种。Aghazadeh 等对67 株PA 菌株进行氨基糖苷类修饰酶基因检测发现aph(3 ＇ )- Ⅱ b 是其中最主要的基因型。
五、与生物被膜形成相关的耐药基因研究
生物被膜是造成抗菌药物耐药的重要原因，指的是一个多菌细胞群体结构，可由细菌自身，及其产生的外部多糖基质、蛋白质和核酸等共同包裹所组成，其通过阻止和抑制白细胞、抗菌药物等进入生物膜中杀灭细菌而产生耐药性。有调查表明，超过65% 的细菌感染与生物被膜形成相关[24]。当生物被膜成熟后，菌体密度增加引起了群体感应系统（quorum sensing，QS）的激活，从而激活特定的基因发生表达。PA 具有QS 系统典型的的特征，其代表为Las 群体感应系统。Las 系统由LasR 和LasI 基因组成，LasR 基因编码转录激活蛋白LasR，LasI 基因编码转录自诱导分子3- 氧十二烷酰高丝氨酸内脂（3-O-C12-HSL）。当3-O-C12-HSL 增加到一定浓度时便分别与Las 蛋白特定性结合并激活转录，从而调节LasA、LasB、aprA 和Rpos 等一系列下游致病基因的表达，调控毒力因子的产生。QS 系统已被证实与抗菌药物的耐药性相关。其机制目前尚不十分清楚，目前存在3 种假说：一是渗透限制，主要从生物膜的结构上分析；二是营养限制，由于细菌密度增加形成了营养成分梯度，被膜内的细菌生长速度出现减慢，从而引起各种耐药基因表达的上调；三是表型推断，指的是膜内某些细菌采用与浮游细菌不同的有保护作用的生物膜表型。其中表型推断是目前解释生物膜耐药的主要研究方向，已被证实。
六、与产生灭活酶相关的耐药基因研究
产生β- 内酰胺酶是PA 耐药的重要机制之一。PA产生的灭活酶包括超广谱β- 内酰胺酶、头孢菌素酶及金属β- 内酰胺酶。灭活酶起作用的途径是破坏β- 内酰胺环。这个过程通过质粒介导或染色体突变产生。
1. 超广谱β- 内酰胺酶（ESBLs）：包括A 类ESBLs 及苯唑西林酶（OXA）。A 类ESBLs 主要包括TEM、SHV、PER、VEB、GES/IBC 和BEL 共6 型，都具有类似的水解作用，但基因同源性不高。OXA 属于Ambler D 类，Bush 2d 组，耐药谱通常较窄，但近年来不断发现超广谱OXA 型酶，主要包括OXA-2 或OXA-10 的突变衍生酶。
2. 头孢菌素酶（又称为AmpC 酶）：AmpC 酶由AmpC 基因编码产生，有很强的诱导性。AmpC 酶可分为诱导型、结构型和质粒型。其中质粒型 AmpC 酶使人类对抗PA 的斗争非常困难，因为其耐药质粒可以在相同菌种间或不同菌种间相互传播。
3. 金属β- 内酰胺酶（MBLs），又称金属酶或碳青霉烯酶。MBLs 的活性部位为金属离子，其活性不能被舒巴坦等常见的β- 内酰胺酶抑制剂抑制，随着这些金属酶的出现，耐亚胺培南PA 的比例在增加，其中以VIM-2 型占主导地位。
目前PA 中发现的MBLs 有IMP、VIM、SPM 和GIM 共4 种类型，耐药基因由染色体或质粒介导。耐药方式产生形式多样，例如耐药酶的水平传播。这是一种借助整合子的移动及基因盒的插入、切除方式实现的传播方式。另外，由于基因环境的不断变化，基因盒与整合子可以出现不断进化，从而使得耐药方式不断更新。综上所述，PA 的耐药机制复杂，耐药相关基因繁多，不同的药物存在着不同的耐药机制，同一类药物亦可以是多种机制相互形成的结果。随着认识及研究的不断深入，新的耐药机制有可能不断被发现，对于PA 的耐药相关基因的研究更待进一步探索。
