农杆菌感受态细胞的制备和转化
实验概要
本实验介绍了根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备及冻融法转化。
主要试剂
利福平，LB培养基，NaCl，CaCl2，YEP培养基，卡那霉素
主要设备
摇床，高速离心机，低温冰箱，水浴锅
实验材料
根癌农杆菌GV3101单菌落
实验步骤
1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；
2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；
3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；
5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；
6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。
2. 冻融法转化农杆菌
1) 冰浴融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞；
2) 加入3ul表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1 min，然后在37℃水浴5min；
3) 加入950uL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；
4) 1 0000rpm离心1 min以浓缩菌液，用100uL YEP回溶菌体；
5) 将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36-48h。菌液PCR检测阳性克隆。
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