皮层扩布性抑制与偏头痛的相关研究进展
偏头痛是一种发病率很高的原发性头痛。根据最新的全球疾病负担研究显示，在50岁以下的人群中偏头痛已跃居致失能性疾病排行榜第一位，严重影响人们的工作和生活。偏头痛的病理生理学机制尚不清楚，一般认为皮层扩布性抑制（cortical spreading depression,CSD）与偏头痛先兆症状相关。
CSD是发生在神经元和神经胶质细胞上的一种缓慢传播的去极化波，速率约为2～5mm/min，持续约1min左右，随后导致数分钟的脑电活动抑制。虽然普遍认为CSD与偏头痛相关，由于相关技术手段的限制，缺少CSD与偏头痛关系的直接证据，CSD是否可以直接引起偏头痛的发作仍不明了。本文将总结CSD的相关特征及最新研究进展，进一步探索CSD与偏头痛的关系，深化偏头痛机制的研究，也为偏头痛进一步的研究和治疗提供新的思路。
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1.CSD的离子、分子机制
CSD的发生被认为与离子浓度失衡有关，其潜在的机制可能与细胞内外离子浓度的快速变化相关，通常是由K+和H+的分泌以及Na+、Ca2+和Cl-的吸收所引起，包括K+的快速外流，Na+、Ca2+、Cl-以及H+的快速内流，产生内向电流。细胞内Ca2+增加的同时，释放到细胞间隙的K+和谷氨酸的浓度增加，兴奋性抑制性失衡，进而改变了局部细胞的兴奋性，引发正反馈循环，最终导致脑功能混乱引发偏头痛。而细胞内外K+的浓度变化被认为是引发皮层扩布性抑制的关键因素。
2.CSD相关的血管及血流动力学改变
虽然早在1944年Leao就指出了CSD与偏头痛先兆症状之间的相似性，但当时普遍认为偏头痛先兆是由于血管痉挛和皮质缺血引起的。后来一系列针对偏头痛发作期间区域脑血流量变化的研究表明，发作初始血管充血，随后是长期的低灌注。这些观察结果驳斥了缺血假说，也是偏头痛的血管痉挛理论的终结。后续的动物研究表明CSD与血管直径的变化显著相关，且与研究的准备工作及研究的动物种类有关。
通过采用内源光信号（optical intrinsic signal,OIS）成像，可透过小鼠的颅骨观察到CSD引起的多相血管反应，在CSD波扩布前可能存在血管的扩张，随后出现与CSD波相关的血管显著收缩，随后血管恢复正常口径或稍扩张状态，然后再持续收缩，持续长达一个小时。在大鼠和其他物种中，血管的收缩可能不是如此显著，并且扩张的时间可延长。且对小鼠的研究表明，硬脑膜和颅骨存在与否会对血管反应产生显著差异，在有硬脑膜和颅骨覆盖的地方会出现更加显著的血管收缩。
在KCl诱导CSD的小鼠模型中，通过采用激光共聚焦荧光显微镜，发现CSD发生时伴随着软脑膜血管快速而显著的收缩，随后扩张，然后再持续收缩。且CSD诱导的区域脑血流量（regional cerebral blood flow,rCBF）增加时不仅伴随着软脑膜血管的扩张，皮层血管也参与rCBF的增加。
目前的数据表明，血流动力学对CSD的反应在CSD波的不同阶段由多个相反的血管运动组成，典型的CBF反应至少有四种不同的血管运动组成：①与直流电位变化（direct current，DC）转变相一致的初始低灌注或血管收缩；②复极期间出现峰值充血或血管扩张，并在完全DC转换恢复后达到最大值；③在CSD之后3～5min发生较小的迟发性充血或血管扩张；④持续一小时或更长时间的SD后血流量减少或血管收缩。且多种因素可影响研究中血流动力学的反应，例如物种和品系的差异，同一物种不同个体间的差异，此外研究的大脑和血管区域的不同，采用的研究技术不同、颅骨或硬脑膜的存在与否、麻醉剂、手术方式、生理状态等均会影响实验结果,因此在进行CSD相关实验时，实验结果可能因各种条件的不同而产生差异。
3.CSD与偏头痛之间的关系
从CSD发现至今，CSD的电生理特性与偏头痛先兆症状之间的相似性，提示两者之间存在因果关系，现有实验证据间接证明CSD是偏头痛先兆的发生机制，基础和临床研究强调，将CSD作为偏头痛先兆的潜在电生理机制，认为它能够激活三叉神经血管系统，诱发与头痛发病相关的神经炎性级联反应，进而引发头痛。研究发现，CSD可引起神经元泛通道连接蛋白（pannexin1,PANX1）通道的开放，高迁移率组蛋白-B1（high-mobility group box 1,HMGB1）和白介素-1β（interleukin-1beta,IL-1β）释放，接着激活星形胶质细胞的NF-κB（nuclear factor-kappa B）信号通路，诱导炎性酶类介质，如诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧合酶2（cyclo oxygenase 2,COX2）等的高表达，触发促炎因子，激活三叉神经血管系统。
最近的动物实验表明，PANX1在扩散去极化后迅速打开，通过与激活的嘌呤能P2X7受体紧密结合所形成的P2X7-PANX1孔隙复合体来介导谷氨酸盐的释放，这个过程与CSD生成的易感性相关。使用P2X7/PANX1孔隙复合体抑制剂或使P2X7的基因缺失，均能够降低CSD的频率并提高其阈值，从而抑制下游的炎症反应和三叉神经血管系统的激活。这表明P2X7/PANX1复合体抑制剂在抑制扩散去极化启动和传播及延长扩散去极化后不应期方面的稳定性和重要性，也为偏头痛的治疗提供新的靶点。
4.CSD相关模型的构建及诱导
关于CSD的实验模型研究主要采用离体和在体两种方式。对于离体实验主要采用细胞、脑片的方式来研究各种药物对CSD性质的影响。离体模型可消除血液动力学、药代动力学、麻醉相关和全身生理因素等条件的影响。然而，暴露于缺血缺氧条件下和实验过程中的副损伤可能会混淆实验结果，并且直接在体外超灌注很难判断临床相关的药物浓度，不利于药物的筛选。在体的动物模型主要在动物麻醉或者清醒状态下进行，动物种类众多，涉及啮齿类动物、鸽子、猴、猫等，并且生理状态下可以更好的了解CSD的相关特征及与偏头痛之间的关系。
在实验动物模型中CSD的诱导通常是将皮质直接暴露于去极化刺激，例如电刺激、化学刺激、局部机械刺激等。一般局部或脑实质内直接应用氯化钾和直流电刺激是最可靠且最常用的诱导CSD的方法，可用以估计对SD的组织敏感性和筛选抗偏头痛药物。电刺激是诱导和评估CSD易感性最直接的方法之一，通过一定频率的刺激强度和时间可诱发CSD的产生，而刺激的电极和电极接触的组织特性会严重影响触发CSD所需的刺激强度。有研究显示以1Hz和20Hz的重复电刺激能明显增加受刺激半球CSD的传播速度，且与1Hz的刺激相比，20Hz刺激对CSD的产生作用更大，传播速度更快，持续时间更长。
诱导CSD的产生及测定CSD易感性的最常见的化学方法是采用一定浓度的KCl溶液（通常浓度为50mM或更高），通常是在硬脑膜上或在皮层内局部应用KCl（0.5-1M），可用于多个CSD的诱导。此外，其他化学刺激，例如谷氨酸、谷氨酸受体激动剂、Ca2+通道开放剂或离子载体（例如BayK8644）、和钠离子通道激活剂，例如乌头碱和钠钾泵抑制剂哇巴音，均可诱导CSD的产生。通过逐步提高去极化剂的浓度或注射的体积来确定产生CSD的阈值；通过连续施加恒定的超阈值浓度（例如1MKCl）以触发重复CSD的产生并确定其频率。
此外，KCl诱导CSD产生的阈值和频率与颅骨窗直径的大小和硬脑膜存在与否相关。因此，在进行CSD的实验时，尽可能保证相一致的实验条件和参数，将大大增加CSD结果的一致性和稳定性。机械刺激也被用于CSD的诱导和易感性的评估，触发CSD的一个基本的机械方法是快速的针刺皮层。针刺方法操作简单，优点是可研究目标区域内的单一CSD波。然而，它不适用于重复CSD的产生，而且它不能测定CSD的阈值。且重复性针刺诱导，可重现性差，其导致的累计性损伤也可影响CSD的特征。此外，与化学或电刺激诱导相比，机械刺激诱导的CSD似乎具有不同的药理学特征。
有研究表明在针刺诱导的CSD中观察了不同的离子通道阻断剂的反应，发现钠离子通道阻滞剂能够抑制CSD引起的猫和大鼠的rCBF变化，而电压依赖性钙通道阻断剂和ATP激活的钾离子通道的阻断剂对CSD的产生和扩布几乎没有影响，表明钠离子通道在机械刺激诱导的CSD所引起的rCBF变化中起主要作用。不论是电刺激、机械刺激还是化学刺激诱导产生CSD均涉及侵入性方法，需要开颅手术联合皮质暴露。虽然这些干预措施能够使神经元去极化，但它们也对神经元、星形胶质细胞等产生非特异性潜在损伤效应，可能有助于CSD的发生。而光遗传技术的出现可以更好的解决这一问题，通过采用相对非侵入性光遗传的方法可特异性激活单个细胞类型，进行脑细胞活性的非侵入性体内调节，诱导CSD的产生，其时空精确性更高，且避免了可能由于电刺激、机械刺激或高浓度化学刺激造成的伪影和组织损伤。
5.CSD的监测
CSD是神经元和神经胶质细胞的一种缓慢传播的去极化波，随后导致数分钟的脑电活动的抑制。所以监测CSD最直接和标准的方法是电生理记录，通过皮质内微电极记录或者在硬脑膜或者颅骨外放置电极，可记录到典型的负向缓慢的电位改变，并且可以测量计算去极化波的传播速度、振幅及持续时间，同时记录脑皮层电位可显示脑电活动抑制情况。
由于CSD发生的同时伴随着显著的rCBF和血管直径的变化，因此可通过激光多普勒或激光散斑成像技术监测CSD的产生，产生的标准为与基线血流值相比血流变化大于20%即可认为CSD的产生。检测CSD的一种替代方法是监测脑组织中光信号的变化。由于血红蛋白浓度和含水量的改变脑组织的光吸收特性的改变。还有一种电压敏感染料与激光散斑技术相结合的方法来研究去极化与相关血流变化之间的关系。
6.清醒状态下CSD相关的行为学表现
虽然普遍认为CSD与偏头痛相关，是偏头痛先兆症状的潜在病理生理学机制，但CSD是否引起与偏头痛相关的头痛仍缺少直接证据。而动物的行为学研究作为研究工具越来越重要，发现啮齿类动物与头痛行为相一致的行为学表现，将提高偏头痛模型的可靠性。CSD是否能引发与头痛相关的行为学表现呢？在一个局部应用N-甲基天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid,NMDA）诱导CSD的研究中，通过评估动物行为学的表现，发现僵直行为（Freezing episodes）是最突出的行为变化，且是唯一的持续性行为改变。一项使用针刺或KCl诱导大鼠皮层CSD产生的研究提示，引起大鼠面部、眶周及后爪等部位的皮肤触痛（allodynia）的刺激是KCl，而非其诱导产生的CSD，并且单独的CSD事件不足以在正常动物上诱发出现皮肤异常性疼痛，如触痛等。
而最近的一项研究显示，CSD能显著诱导自由移动大鼠的僵直、理毛等头痛相关行为的发生，而使用CGRP（calcitonin gene-related peptide）受体拮抗剂MK-8825可减少的僵直、理毛、甩头、湿狗征（wet dog shake）等头痛相关行为的数量。CGRP受体拮抗剂MK-8825剂量依赖性地减弱CSD诱导的三叉神经介导的疼痛反应。
CSD和疼痛行为之间的联系并没有在清醒自由移动的啮齿类动物广泛评估，仍需要进一步探索，以期构建更加完善的CSD动物模型，明确CSD与偏头痛疼痛之间的关系。
7.CSD的影响因素
1）基因：偏头痛具有家族遗传倾向，目前已知的偏头痛发病机制研究结果多来自于对家族性偏瘫性偏头痛（familial hemiplegic migraine,FHM）相关基因的研究。FHM是常染色体显性遗传的偏瘫性偏头痛（hemiplegic migraine,HM）。HM则是先兆偏头痛的一种严重亚型，其先兆症状主要为运动先兆，经常表现为一侧肢体暂时性的麻木或无力。由于这种运动先兆具有自发性的特点，且表型显著、能够量化，又具有明确的致病因素，因而在偏头痛发生机制的基础研究中备受关注。但是具体的遗传机制尚不明确。
HM致病基因有三种，分别编码三种不同的离子通道：FHM1型基因CACNA1A编码Cav2.1离子通道α1A亚基，FHM2型基因ATP1A2编码Na+-K+-ATP酶α2亚基，FHM3型基因SCN1A编码Nav1.1离子通道的α1亚基。已经培育出的FHM1型致病基因敲入小鼠模型具有明确的CSD诱发易感性，这种易感性与刺激强度呈正相关，并且是由于基因突变导致突触前膜的谷氨酸能神经元功能失调所致。FHM2型致病基因敲入小鼠模型同样具有CSD诱发的易感性，且由于星形胶质细胞上的ATP1A2功能丧失，导致星形胶质细胞清楚突触间隙内谷氨酸能力降低，从而导致突触后膜的兴奋性神经元更加兴奋，更易诱发出CSD。与野生型小鼠相比，这些基因敲入小鼠被诱发产生的CSD更易传播到皮质下结构中。
2）性别：流行病学研究显示偏头痛在女性中的发病率较高，女性是男性的2～3倍。啮齿类动物的CSD易感性也因雌性因素而增加。雌性小鼠表现出诱导CSD的较低阈值，表达人类偏头痛相关基因的雌性转基因小鼠与其雄性相比，表现出对CSD的易感性增加。这些发现与女性偏头痛患病率显着高于男性相一致，说明性别因素与偏头痛的关系密切。
有动物研究显示与CSD诱导相关的神经元兴奋性在小鼠的自然发情周期中不同。小鼠的自然发情周期包括发情前期、发情期、发情后期、间情期。在发情间期，与其他三期和雄性动物相比，雌性小鼠诱发CSD所需的最低钾浓度明显降低；与发情期相比，发情间期雌二醇的血清水平显着升高，孕激素的血清水平显着降低。此外，当使用雌激素受体拮抗剂时，CSD传播的易感性降低；相反，施用孕酮受体拮抗剂增对CSD的敏感性增加。这些研究表明，女性可以与偏头痛的遗传倾向相互作用，以进一步增加CSD的倾向。
3）生理状态：机体的生理状态也能影响CSD的相关特征。在CSD易感性的动物实验模型中，必须监测动物系统生理学的变化，必要时采用机械通气，其中动脉血压、血氧水平、血糖、体温能量代谢水平等因素均会影响CSD的相关特征：
①动脉血压能够影响CSD的持续时间和频率，研究表明动脉血压与CSD的持续时间呈反比。低血压能够延长CSD的持续时间，而采用持续降低血压的药物可降低CSD的频率。而动脉血压与CSD阈值之间的关系尚不明确；
②血氧水平也是影响CSD特征的重要因素，缺氧条件下CSD的易感性显著增加。在CSD发生的同时伴随着离子浓度的变化，而恢复正常的离子浓度梯度需要大量的能量消耗，氧气利用水平增加，因此缺氧条件下会显著影响CSD后脑组织正常代谢的恢复；
③血糖水平也是影响皮层扩布性抑制的重要因素，高血糖可抑制SD易感性，而低血糖可延长SD持续时间。最近的一项研究发现星形胶质细胞末端的糖原有助于维持细胞外低谷氨酸和突触周围的K+浓度，糖原水平在细胞外k+的清除中起关键作用。但也有研究认为高血糖水平并不能改变CSD的传播时间，也不能显著影响CSD的传播速度和血流变化；
④动脉血气和PH值也可能间接影响CSD的特征，但尚未得到系统研究。因此，在关于皮层扩布性抑制的相关实验中，有必要监测这些生理特征并将其保持在正常生理范围内。
4）麻醉类型：麻醉剂的类型和麻醉的深浅也影响CSD的易感性、传播频率和传播速度等。在一项应用KCl诱导CSD的动物模型中，与丙泊酚和戊巴比妥相比，异氟烷和右旋美托咪定能显著抑制CSD频率，且降低CSD的传播速度。
而另一项研究则表明在相同条件下诱发CSD，与丙泊酚相比，异氟烷诱发的CSD数目更少，采用异氟烷的情况下基线血流和血糖更高，组织代谢条件更好。因此不同麻醉剂、不同生理状态下对CSD的影响也更为复杂。因此在CSD相关实验中应严格控制相关实验条件，避免使用与测试药物作用机制相同的麻醉剂，避免混淆结果、降低待测药物的敏感性。
此外，须量化麻醉的相关指标，确定麻醉诱导和维持对CSD易感性的直接影响及权衡麻醉剂对待测药物或突变之间可能的相互作用。综上所述，皮层扩布性抑制与偏头痛的关系密切，尽管普遍认为皮层扩布性抑制是偏头痛先兆的病理生理学机制之一，但是皮层扩布性抑制与偏头痛之间明确的关系并未阐明，因此CSD是否能引发头痛有待进一步的探索。目前相关CSD动物模型的研究也大多在麻醉状态下，清醒状态下研究较少，随着研究技术的进步，建立更加完善的清醒状态下动物CSD模型将有助于厘清CSD的特性和偏头痛相关机制的研究。
