饲料中的氯霉素的测定——气相色谱法
引言
氯霉素（Chloramphenicol， CAP） 是一种广泛使用的广谱类抗生素， 由于它对人体具有严重的毒副作用 [1]， 医学界至今还没有确定氯霉素的人体安全接触剂量。 美国和欧盟都禁止在食用性动物和动物饲料中使用氯霉素 [2]， 在法规中CAP 的残留量为不得检出。
气相色谱的 ECD 检测器对于具有强电子亲和力的化合物有较高的灵敏度， 而本实验采用 Thermo Scientific Trace1310 气相色谱，在分析饲料中的氯霉素时，简单、 方便，重现性好。
实验材料
仪器与试剂
Trace 1310 气相色谱仪， 配备了 SSL（分流 / 不分流进样口），ECD( 电子捕获检测器 )；
自动进样器： AS 1310
色谱工作站： Chromeleon 7.2
氯霉素标准品（99.5%）； 衍生化试剂： 三氟双（三甲基硅烷基） 乙酰胺（BSTFA） + 三甲基氯硅烷（TMCS）（99:1，美国 SUPELCO 公司） C18 固相萃取柱（美国 SUPELCO 公司），填料 300mg； 乙酸乙酯， 正己烷， 甲醇， 乙腈均为色谱纯，氯化钠为分析纯。
样品： 购自山东猪饲料
实验方法
1. 标准溶液配制
电子天平准确称取 10.0mg 氯霉素标准品， 色谱纯甲醇溶解定容到 100ml， 充分摇匀， 配制成 100ug/ml 的标准溶液储备液， 置于 4℃冰箱中保存。 制作工作曲线时， 再取此储备液用甲醇配制成其他浓度的标准溶液。
2. 样品预处理方法 [3]：
2.1 提取
称取饲料 5.00g 左右， 置于 50ml 塑料离心管内， 加入 40ml乙酸乙酯， 盖好密封盖于涡旋混合器上混合 2min， 超声提取 20min。 离心机上 4000r/min 离心分离 4min， 取上清液20.0ml， 用氮气吹至近干， 待净化。
2.2 液液萃取净化
称取 4.0g 氯化钠加水溶解定容到 100ml， 配制 4% 的氯化钠溶液。 取 20ml 甲醇加 4% 的氯化钠溶液 80ml， 配制成氯化钠甲醇溶液。 用氯化钠甲醇溶液 2ml 分三次溶解残渣，均转移到一个 15ml 的具塞离心管中， 加 4ml 正己烷， 涡旋混合 2min。 然后 4000r/min 离心 4min， 吸取上层正己烷弃去，重复上述操作一次。 水相加乙酸乙酯 3ml， 混合 2min，4000r/min 离心 4min， 吸取上层乙酸乙酯， 同样的步骤重复两次。 然后氮气吹干， 用 3ml5% 的乙腈 - 水溶解， 待柱净化。
2.3 固相萃取柱净化
准备好 C18 小柱， 顺序用 5ml 甲醇， 5ml 三氯甲烷， 5ml 甲醇和 5ml 水活化 C18 柱。 将处理好的样品转移到柱上， 用5ml 水淋洗， 然后用 6ml 乙腈洗脱， 收集在离心管中， 用氮气吹干， 待衍生化。
2.4 衍生化
向干的残留物中加入 100ul 衍生化试剂， 盖塞并涡旋混合 10s。 在 65℃的水浴中反应 60min， 然后用氮气吹除多余的试剂。 加入 0.25ml 正己烷， 涡旋混合 10s， 供色谱分析使用。 标准溶液， 吹干后， 采用同样的衍生化方法处理。
3. 测定
3.1 色谱条件
分析结果与谱图
1. 气相色谱对氯霉素分析结果
采用 ECD 检测器对氯霉素衍生化样品进行分析， 得到的谱图如图 1 所示：
2. 工作曲线、 回收率和精密度
配置浓度分别为 200,100,50,20,10,5ug/L 的标准样品， 衍生化后， 用 ECD 模式下检测， 得到的线性、 检出限结果如表 2所示
称取饲料样品， 分别添加 2 个水平浓度的标准品， 每个浓度水平平行测定 5 次。 结果表明， 平均回收率为 80-85%，相对标准偏差（RSD, n=5） 为 1.4-5%。 回收率和精密度数据结果见表 3。
3. 实际样品
称取 5.0g 购得的猪饲料中， 平行检测两次， 未检出氯霉素残留
结论
Thermo Scientific 的气相色谱 Trace 1310 分析饲料中的氯霉素检测限可以达到 2ug/kg, 定量限达到 5ug/kg, 优于 GB/T8381.9-2005 中对于饲料中氯霉素 5ug/kg 的检测限要求。 在分析氯霉素质量浓度为 5-200ug/kg 时， 线性良好， 重现性。
参考文献
[1] 蒋定国， 杨大进， 动物性食品中氯霉素残留检测技术的研究概况 [J]. 中国食品卫生杂志： 2002,14（2）： 44-47；
[2] 徐继林， 严小军， 徐年军， 冯凯， 对虾中残留氯霉素的化学源 GC/MS 分析 [J].中国水产科学： 2004,11（2）： 111；
[3] GB/T 8381.9-2005 饲料中氯霉素的测定 气相色谱法： 2-3
